Простой протокол анализа ям для визуализации и количественной оценки остеокластической резорбции in vitro

Наш протокол описывает простой и надежный метод остеокластического резорбционного анализа. Использование пластин для культивирования клеток, покрытых фосфатом кальция, может быть легко подготовлено и визуализировано с использованием доступных в лаборатории материалов. В отличие от непрозрачных костных или дентиновых срезов, покрытие из фосфата кальция позволяет одновременно визуализировать резорбционные ямки и клетки.

В этом протоколе мы используем BBMC для дифференцировки остеокластов. Тем не менее, он также может быть применен к другим типам клеток, таким как моноциты, полученные из костного мозга, или сырые клетки 264,7. Сначала берут плоское дно 96 клеточной культуральной пластины и пипетку 300 микролитров предварительно приготовленного раствора фосфата кальция в каждую скважину.

Затем накройте тарелку крышкой и высиживайте пластину при 37 градусах Цельсия в течение трех дней. Через три дня аспирируют раствор предварительной кальцификации из предварительно кальцинированных пластин для культивирования 96 лунок и добавляют 300 микролитров раствора фосфата кальция в каждую лунку. Накройте тарелки крышкой и высиживайте при 37 градусах Цельсия в течение одного дня.

Затем переверните тарелку, чтобы вылить раствор и трижды тщательно промыть тарелку деионизированной водой. Немедленно высушите пластину с помощью фена или сжатого углекислого газа или газообразного азота для поддержания однородной поверхности. Теперь облучите покрытую пластину на чистой скамейке ультрафиолетовыми лучами в течение одного часа.

Немедленно используйте пластину с покрытием или запечатайте пластину парапленкой и храните ее при комнатной температуре. Развести 15 миллилитров свежей крови равным объемом PBS и перемешать их путем инвертирования или пипетирования несколько раз. Затем берут 15 миллилитров раствора градиента плотности в конической трубке объемом 50 миллилитров, наклоняют трубку и аккуратно наслаивают 30 миллилитров разбавленного образца крови на 15 миллилитров раствора градиента плотности.

Позже центрифугируют трубку в качающийся ротор ковша без разрыва в 810 раз G в течение 20 минут при 20 градусах Цельсия. Затем аспирируйте верхний слой, оставляя слой мононуклеарных клеток нетронутым на границе раздела. Аккуратно переложите слой мононуклеарной ячейки на новую коническую трубку объемом 50 миллилитров.

Наполните трубку PBS, перемешайте и центрифугируйте в 300 раз G в течение 10 минут при температуре 20 градусов Цельсия. Повторно суспендировать PBMC в полном альфа-MEM, содержащем 20 нанограммов на миллилитры макрофагального колониестимулирующего фактора, и засеять 2,5 раза 10 до пятых клеток на сантиметр квадратных PBMC в колбе. Инкубируйте пластины, покрытые фосфатом кальция, 50 микролитрами фетальной бычьей сыворотки при температуре 37 градусов Цельсия в течение одного часа.

Затем дважды промыть колбу PBS, чтобы отделить предшественники остеокластов от мертвых или неадгезивных клеток, затем добавить четыре миллилитра трипсина на колбу площадью 75 квадратных сантиметров. Через 30 минут остановите пищеварение, добавив четыре миллилитра полного альфа-MEM, затем аккуратно отсоедините клетки с помощью клеточного скребка. Переместите ячейки в 50-миллилитровую трубку и подсчитайте общее количество ячеек с помощью счетной камеры.

Центрифугируйте трубку в 350 раз G в течение семи минут, чтобы гранулировать клетки и повторно отраспределить гранулу и полный альфа-MEM, содержащий M-CSF и RANKL, чтобы получить от одного раза 10 до шести ячеек на миллилитр. Аспирируйте фетальную бычью сыворотку из пластины, покрытой фосфатом кальция, и пипетку 200 микролитров клеточной суспензии на лунку. После инкубации дважды промыть клетки PBS.

Зафиксируйте клетки с 4% параформальдегидом в течение 10 минут и снова промыть PBS. Для окрашивания добавьте буфер пермеабилизации к неподвижным клеткам и инкубируйте их в течение пяти минут. Чтобы окрасить актиновые нити, инкубируют клетки 100 микролитрами меченого раствора фаллоидина Alexa Fluor 546 в PBS в течение 30 минут, затем аспирируют окрашивающий раствор и окрашивают ядра, используя 100 микролитров Hoechst в течение 10 минут.

Окрашивайте покрытие фосфатом кальция 100 микролитрами 10 микромолярного кальция и PBS в течение 10 минут. После трехкратного мытья PBS, делайте снимки. Для окрашивания покрытия фосфатом кальция фон Косса добавляют в каждую скважину 50 микролитров 5% нитрата серебра и деионизированной воды и инкубируют пластину под ультрафиолетовым излучением в течение одного часа, пока покрытие на дне скважин не станет коричневым.

Покрытие фосфата кальция на дне 96 плит скважин оказалось однородным и хорошо приклеенным. После девяти дней культивирования в M-CSF и RANKL на пластинах, покрытых фосфатом кальция, предшественники остеокластов образовали ямки резорбции и крупные остеокласты. Многоядерные остеокласты, расположенные в ямах, экспрессировали высокие уровни TRAP.

Зрелые остеокласты показали наличие трех или более ядер и отчетливого актинового кольца. Зеленое покрытие из фосфата кальция показало наличие черных ямок резорбции. Количество и размер остеокластов рассчитывались с помощью менеджера ROI и инструмента выбора полигонов изображения J.Предшественники J.Osteoclasts, выращенные в отсутствие RANKL, не могли образовывать резорбционные ямы, однако M-CSF и RANKL способствовали образованию остеокластогенных ямок.

А площадь карьера была количественно определена с помощью изображения J.Немедленное высыхание покрытой пластины воздушным потоком помогает сделать равномерное покрытие из фосфата кальция. В противном случае он склонен к образованию более толстого покрытия в середине скважины.