Использование двойного оптического пинцета и микрофлюидики для исследований одной молекулы

Прикрепление портов для сопряжения со шприцами с трубкой имеет решающее значение, потому что, когда все сделано правильно, нет утечек, нет пузырьков в проточной ячейке, и эксперименты могут проводиться многократно с использованием одной и той же проточной ячейки в течение одного года при тщательном использовании. Здесь будут представлены два простых метода крепления разъемов к проточным ячейкам. Они просты, они воспроизводимы и позволяют исследователю легко адаптировать проточную клетку к своим потребностям без особых проблем.

Использование этих проточных клеток было сделано с учетом экспериментов с одной молекулой. В частности, то, что мы называем визуальной биохимией, но они могут быть использованы в любом исследовании, где требуется микрофлюидика, и в ситуациях, когда должен использоваться поток жидкости lamina. Поэтому, чтобы избежать ошибок, вместо того, чтобы использовать ценные проточные ячейки для создания методов, я бы предложил сначала попрактиковаться на стеклянной горке или крышке.

Это позволит почувствовать стекло или материалы PDMS, чтобы знать, как с ними обращаться и сколько силы приложить при вставке трубки или склеивании разъемов. Это потребует пожертвовать некоторыми разъемами, но они намного дешевле, чем проточные ячейки. Начните с размещения проточной ячейки на чистой ровной поверхности.

Удерживайте трубку из PTFE в трех миллиметрах от свободного конца щипцами и проталкивайте трубку в порт. Повторите эту процедуру для каждого из оставшихся портов. Подключите впускные отверстия к шприцевому насосу, а выходное отверстие — к бутылке для отходов.

Наполните каждый стеклянный шприц одним миллилитром спектрофотерметрического метанола и прикрепите их к переключающему клапану. Убедитесь, что клапан имеет выходное отверстие, направленное на отходы, и продувьте каждую линию 50 микролитрами метанола. Переключите выходное положение на проточную ячейку и прокачайте 800 микролитров метанола через проточную ячейку со скоростью потока 100 микролитров в час, чтобы смочить поверхности и устранить пузырьки.

На следующий день повторите этот процесс, используя 800 микролитров сверхчистой воды. Теперь проточная ячейка готова к использованию. Если необходимо использовать нажимные соединители трубки, осторожно снимите клейкую ленту с одной стороны разъема и поместите ее над отверстием в слайде микроскопа.

Нажмите вниз в течение нескольких секунд. Повторите этот процесс для остальных соединителей. Затем поместите проточную ячейку на чистую плоскую поверхность.

Удерживайте трубку из PTFE в трех миллиметрах от свободного конца и проталкивайте трубку в отверстие в порту. Повторите эту процедуру для каждого из оставшихся портов. Прикрепите трубку от впускных отверстий к переключающим клапанам.

Поместите насадку либо на чистую плоскую поверхность, либо на специально изготовленный коллектор, чтобы удерживать проточную ячейку и соединители на месте во время склеивания. Поместите проточную ячейку на утопленную секцию коллектора, затем поместите небольшое количество стеклянного клея на нижнюю часть сборки и вставьте уплотнение. Расположите нанопорт над одним из входных отверстий на слайде микроскопа.

Осторожно надавите вниз и удерживайте на месте без бокового движения. Повторите этот процесс для остальных портов. Дайте высохнуть или зажать на месте в коллекторе.

Осторожно извлеките проточную ячейку из коллектора и убедитесь, что сборки хорошо выровнены с входными портами в проточной ячейке. Поместите проточную ячейку на ступень микроскопа и прикрепите трубку с помощью герметичных разъемов. Наполните каждый стеклянный шприц одним миллилитром спектрофотерметрического метанола.

Прикрепите каждый шприц к переключающему клапану. Убедитесь, что клапан имеет выходное отверстие, направленное на отходы, и продувьте каждую линию 50 микролитрами метанола. Переключите выходное положение на проточную ячейку и прокачайте 800 микролитров метанола через проточную ячейку со скоростью потока 100 микролитров в час.

На следующий день повторите этот процесс, используя 800 микролитров сверхчистой воды. Измерение выходной мощности показано здесь. Выходная мощность от лазера измеряется перед установкой лазерной головки в оптическую компоновку.

После выравнивания ловушки мощность луча измеряется после цели 100 x для каждой ловушки. Изображения демонстрируют стабильную оптическую ловушку одного микрометра флуоресцентных шариков. Здесь F — фиксированная ловушка, а M — мобильная ловушка.

При этом подвижная ловушка в режиме сканирования перемещается по малому или большому кругу на 30 герц. Поток жидкости внутри проточной ячейки ламинарный. Схема показывает проточную ячейку сверху, чтобы продемонстрировать, что межканальная диффузия является основным источником смешивания между соседними потоками жидкости.

Синие стрелки указывают направление потока, а отдельные потоки окрашены, белые, светло-серые и белые. Расширяющиеся области поперечной диффузии между каналами обозначены красным цветом. Вставка показывает флуоресцентное изображение соседних потоков жидкости при 10-кратном увеличении с флуоресцентно мечеными комплексами БУСИН ДНК в нижнем потоке и буферами только в верхнем потоке.

Белые пятна в верхнем потоке снимают шум с ПЗС-камеры. Профиль потока и пластинчатые ячейки потока параболические. Проточная ячейка просматривается сбоку и направление потока указывается над каждой ячейкой.

Линейная скорость шарика зависит от скорости насоса и концентрации сахарозы. На противоположную силу на шарике влияет вязкость раствора. Диаметр бусины влияет на силу на бусины под потоком.

При попытке этой процедуры убедитесь, что область, в которой вы работаете, чиста и что вы очистили стеклянные поверхности спектрометрическим метанолом или ацетоном. На этом этапе у вас должна быть проточная ячейка, которая помещается в ваш шприцевой насос, и теперь вы готовы представить свои решения и начать эксперименты с оптическим пинцетом. Использование проточных клеток, которые могут использоваться в течение длительных периодов времени, позволило исследователям исследовать различные реакции с одной молекулой, где измеряются либо силы, либо реакции визуализируются флуоресценцией, либо комбинация обоих.