Микротрансплантация синаптических мембран для реактивации синаптических рецепторов человека для функциональных исследований

Нейродегенеративные и психические расстройства являются результатом изменений в синаптической коммуникации. Многофакторные события изменяют синаптические рецепторы способами, которые мы не до конца понимаем. Микротрансплантация синаптических мембран дает представление об этих изменениях.

Основным преимуществом данной методики является возможность фиксировать активность нативных рецепторов мозга, работающих в головном мозге человека, а значит, представлять изучаемые нами заболевания. Синаптические рецепторы являются основными мишенями для медицины, регулирующей электрическую активность мозга, но, понимая, как эти рецепторы изменяются, можно разработать лучшие методы лечения, восстанавливающие их функциональность. Этот метод был успешно применен к различным видам, от насекомых, рыб, млекопитающих, но также может быть применен к мембранным рецепторам вне мозга, например, мышцам и опухолям.

Возможности широки. Обрезка инъекционных игл сложна. Слишком маленький может предотвратить инъекцию белка, а два больших могут убить клетку.

Это помогает использовать последовательное измерение, например, лезвие лезвия бритвы. Начните с обработки ультразвуком отобранных образцов, приготовленных из интересующей области человеческого мозга, три раза в ванне с плавающим влажным льдом. Используйте пять секунд каждый раз и подождите одну минуту на влажном льду между циклами.

Поместите один микролитр образца на термопластик и сделайте углубление на поверхности, если это необходимо, перед размещением образца, чтобы предотвратить движение образца. Используйте ручки манипулятора, удерживающие наноинжектор, чтобы расположить иглу и переместить ее к образцу, который нужно заполнить. Как только кончик иглы окажется в образце, нажмите и удерживайте кнопку заполнения, пока не будет взято достаточное количество образца.

Для 10 ооцитов требуется около 0,5 микролитра образца. Используйте ручки, чтобы переместить иглу наноинжектора обратно в самое высокое положение. Проникните в яйцеклетку прямо под поверхностью с помощью иглы, не глубже, и используйте ножную педаль для введения образца.

Подождите около двух-трех секунд. После успешной инъекции клетка расширится. Используйте ручки манипулятора, чтобы выйти из ячейки.

Переместите чашку Петри так, чтобы следующая яйцеклетка была выровнена с иглой. Повторяйте процесс до тех пор, пока не будет введено нужное количество ооцитов в чашке, затем втягивайте наноинжектор в исходное положение и извлекайте иглу. Убедитесь, что один колодец ооцитов не введен для использования в качестве контроля.

Включите все оборудование, используемое для записи ионных токов, затем включите настольный компьютер и войдите в WinEDR версии 3.9.1. Убедитесь, что программа запущена, а для записи установлено значение Disc. После этого установите продолжительность записи и очистите опцию Симулятор.

Для секции электрода напряжения отключите компенсацию отрицательной мощности. Установите переключатель селектора усиления на 10 для секции электрода ванны, затем установите переключатель с тремя позициями, который выбирает множитель усиления, на x1. Светодиодные индикаторы будут указывать на выбор множителя усиления.

Выключите селектор режима зажима, включите элемент управления усилением постоянного тока и установите регулятор усиления примерно на половину полной разомкнутой петли полосы пропускания. Задайте для команд значение 40 милливольт, для элементов управления удержанием — отрицательное значение, а для множителя шкалы — значение x2. Для электрода тока используйте смещение VE, чтобы установить нулевой эталон, прежде чем пронзить ооцит.

Затем откройте программное обеспечение WinEDR версии 3.9.1, перейдите в верхнее меню и выберите Файл, а затем Создать. Создайте собственную папку и сохраните файл. В главном меню выберите Запись, а затем Запись на диск.

Поместите агаровые мостики в соответствующие круглые отверстия за регистрирующей камерой, соединяя колодцы для электродов, используемых в качестве наземного эталона в записывающей камере. Добавьте 1x рабочий раствор звонаря к соответствующему перфузионному клапану. Откройте клапан до тех пор, пока записывающая камера не будет заполнена раствором Рингера.

Используя правый и левый манипуляторы, удерживающие электроды, направьте иглы электродов в камеру записи, заполненную раствором Рингера. Проверьте сопротивление каждого электрода, обнулив ручки смещения VM и VE, а затем нажав кнопки тестирования электрода. Сопротивление должно составлять от 0,5 до трех мегаом.

Если сопротивление находится вне диапазона, замените его с помощью новых микроэлектродов. Затем заполните камеру записи свежим решением Рингера. Используйте стеклянную пипетку, чтобы поместить неинъецированную или микротрансплантированную яйцеклетку в центр записывающей камеры.

Убедитесь, что яйцеклетка хорошо видна под микроскопом животной стороной вверх. Направляйте электрод в раствор Рингера до тех пор, пока они не коснутся мембраны ооцитов. Аккуратно проткните мембрану ооцитов со стороны животного обоими электродами и запишите мембранный потенциал покоя.

Включите поток решения звонка. Используя усилитель Oocyte Clamp, измените режим на медленный зажим напряжения и установите удерживающее напряжение на 80 милливольт. Ток на мониторе должен быть отрицательным, обычно от 0 до 0,4 микроампер.

Перейдите в раздел Файл, Создать, а затем сохраните запись в программном обеспечении, чтобы создать новый файл, и сохраните запись. Нажмите «Запись», а затем «Запись на диск», чтобы начать запись. Добавьте соответствующую информацию в файл с помощью диалогового окна Mark Chart.

Применяйте агонисты для химической стимуляции, открыв клапаны и перфузировав их в записывающую камеру в течение 15 секунд. После завершения записи поверните зажим напряжения в выключенное положение и выключите клапан Ringer's Solution. Удалите яйцеклетку и выбросьте в соответствии с институциональной политикой для образцов человеческого мозга, затем остановите запись и сохраните файл.

Сохраните копию записей на USB-накопитель. Оттуда откройте нужный файл для анализа. Чтобы измерить максимальный отклик AMPA и пиковый отклик GABA A, сначала установите уровень 0 или базовую линию, найдя красную линию, а затем перетащите ее к току, генерируемому приложением Ringer или базовой линией.

Как только уровень 0 установлен, определите измерения отклика, перетащив зеленый вертикальный курсор считывания в нужную часть трассировщика графика. Регистрировались ионные токи от ооцитов, вводимых мембранами от синаптических рецепторов человека. Рецепторы AMPA активировались 100 микромолярным каинатом, а рецепторы ГАМК А — одним миллимолярным ГАМК.

Совместная инъекция отфильтрованных мембран из электрического органа торпеды, богатого ацетилхолиновыми рецепторами, и кДНК, кодирующей рецептор ГАМК первого ряда, в полюс животного продуцировала в основном две группы ооцитов, основываясь на их ответах. Одна группа ооцитов имела большие ответы на ацетилхолин, но не реагировала на один микромолярный ГАМК. Ооциты в другой группе имели нулевые или низкие реакции на ацетилхолин, но большие ответы на ГАМК.

На графическом изображении показано среднее плюс минус стандартная погрешность среднего пикового тока в первой и второй группах. Один ооцит во второй группе имел большие реакции ГАМК и ацетилхолина, что свидетельствует о разрыве ядра. Следовательно, распределение ответов было искажено до низких значений, что было отмечено разницей между средним и медианой распределения мембранного тока.

Одной из причин низкого ответа ооцитов является то, что мембраны вводятся и захватываются в ядро ооцита. Здесь показаны реакции ГАМК и кайнатов ооцитов, вводимых в животные или растительные полюса с нефильтрованными мембранами, полученными из мозга без AD, и мозга AD. Ооциты, введенные вблизи полюса животных без нацеливания на ядро, давали большие ответы, чем ооциты, введенные в вегетативный полюс, что позволяло изучать образцы тканей с очень низким количеством рецепторов.

При выполнении этой процедуры всегда следите за уровнем звонка. Это всегда во время важных записей, что вы закончите, и тогда он будет использовать ваш результат, и смерть яйцеклетки, и потерю очень ценных данных. Следуя этой процедуре, мы можем выполнять западные нагрузки, чтобы подтвердить наличие синаптических рецепторов или белков, представляющих интерес.

Он позволяет измерить глобальное возбуждение к ингибированию синаптических соотношений в разных областях мозга и различных мозговых расстройствах, позволяя сделать прямую проверку на теоретическое прогнозирование причин заболевания.