В пробирке Восстановление актин-цитоскелета внутри гигантских одноцветных везикул

В этой рукописи мы демонстрируем экспериментальные методы инкапсулирования F-актинового цитоскелета в гигантские одноламеллярные липидные везикулы (также называемые липосомами) и метод формирования биомимикирующего коры F-актинового слоя на внутреннем листке липосомной мембраны.

Эта мера строит минимальную модель клетки, лишенную сложных биохимических регуляций. Используемый метод может генерировать высокий выход липосом и иметь высокую эффективность инкапсуляции для белков цитоскелета. Эта мера может быть применена к инкапсуляции различных белков и крупных объектов, таких как микрочастицы и самоподготовившиеся микропловцы.

Человек изо всех сил пытается увеличить выход липосом в течение первых нескольких попыток. Рекомендуется регулярно обсуждать раздел рукописи для более подробного повышения урожайности. Для начала подготовьте водный внутренний неполимеризационный буфер в общем объеме пяти миллилитров путем смешивания 0,1 миллимоляра CACL два, 10 миллимоляров HEPES, одного миллимоляра DTT, 0,5 миллимоляра DAPCO, 320 миллимолярной сахарозы и 0,2 миллимолярной АТФ.

Приготовьте белковую смесь, добавив белки во внутренний неполимеризационный буфер при четырех градусах Цельсия. Чтобы сформировать актиновый слой, добавьте в белковую смесь 100 наномолярных геллкалинов, четыре микромоляльных кашалина и 2,2 микромолярного VCA HEZ. В качестве контрольного эксперимента замените белковую смесь 100 микрограммами на миллилитр флуоресцентного красителя.

Готовят водный внутренний полимеризационный буфер в общем объеме пять миллилитров путем смешивания 100 миллимоляров хлорида калия. Четыре миллимоляра хлорида магния, 10 миллимоляров HEPES, один миллимоляр DTT, 0,5 миллимоляр DABCO, 10 миллимоляров АТФ и 80 миллимоляров сахарозы. Подготовьте конечный буфер путем смешивания внутреннего неполимеризационного буфера и внутреннего полимеризационного буфера в объемном соотношении один к одному, чтобы получить внутренний водный раствор в общем объеме 30 микролитров, которые будут инкапсулированы внутри липосомы.

Готовят водный внешний буфер в общем объеме 150 микролитров путем смешивания 10 миллимоляров HEPES, 50 миллимоляров хлорида калия, двух миллимоляров хлорида магния, 0,2 миллимоляра хлорида кальция, двух миллимоляров АТФ, одного миллимоляра DTT, 0,5 миллимоляра DAPCO, 212 миллимоляров глюкозы и 0,1 миллиграмма на миллилитр бета-оболочки. Чтобы приготовить смесь липидных масел, начните с добавления 100 микролитров по 25 миллиграммов на миллилитр EGGPC в стеклянный флакон. Испаряют хлороформ с газообразным аргоном, оставляя сухую твердую липидную пленку на дне флакона.

Чтобы сформировать актиновый слой, добавляют липид никеля в соотношении 10 к одному EGGPC к липиду никеля и смешивают перед испарением хлороформа. Добавьте два миллилитра минерального масла. Выпаривают хлороформ и обрабатывают ультразвуком липидную масляную смесь при комнатной температуре в ванне в течение одного часа, чтобы повторно суспендировать липиды.

Подготовьте конечный буфер в масляной эмульсии для получения монослойных липидных капель, содержащих интересующий белок. Начните с того, что возьмите 100 микролитров смеси липидного масла в пластиковой трубке и добавьте 10 микролитров конечного буфера в липидную масляную смесь. Убедитесь, что конечный буфер находится в одной капле.

С помощью стеклянного шприца сначала нарисуйте небольшое количество смеси липидного масла, а затем конечную буферную каплю, поместив кончик шприца на периферию капли, чтобы разбить ее на крошечные капли. Осторожно аспирируйте вверх и вниз несколько раз, пока не образуется мутная эмульсия. Поместите 30 микролитров наружного буфера в отдельную пластиковую трубку.

Поместите 30 микролитров липидной масляной смеси поверх внешнего буфера и оставьте его примерно на 10 минут, чтобы образовался липидный монослой на границе раздела. Чтобы приготовить липосомы, осторожно добавьте 50 микролитров конечной буферной масляной эмульсии в верхнюю масляную фазу трубки. Центрифугируйте пластиковую трубку в 100 раз G в течение 15 минут при четырех градусах Цельсия.

Варьируйте время и скорость центрифугирования, чтобы оптимизировать образование липосом. Осторожно удалите масляную фазу пипеткой аспирата дополнительного объема, если это необходимо. Убедитесь, что кончик пипетки не помещается сбоку трубки, чтобы избежать создания мениска масла поверх фазы липосомы.

Новой пипеткой вырежьте кончик пипетки. Медленно вставьте пипетку в оставшуюся нижнюю фазу и аспирируйте водный объем, чтобы собрать липосомы. Вылейте 100 микролитров наружного буфера в колодец инкубационной камеры.

Аккуратно нанесите собранные липосомы во внешний буфер, а затем поместите еще один крышку поверх камеры. Наблюдайте за липосомами с помощью конфокального микроскопа с помощью 63-кратного масляного погружного объектива. Используйте лазерные линии 488, 647 и 561 нанометр.

Наблюдать флуоресцентно меченый липид, инкапсулированный флуоресцентный краситель и инкапсулированный флуоресцентно меченый актин соответственно. Захватите интересующие кадры и сохраните изображения в формате TIF. Обработка и анализ изображений в изображении J.Начните с открытия файла TIF с помощью программного обеспечения image J.

Перейдите к изображению, затем нажмите кнопку «Настроить». Затем контраст яркости отрегулируйте яркость и контрастность изображения до нужного масштаба, настроив минимальные и максимальные настройки и ползунки яркости и контрастности. Нажмите на инструмент выделения прямоугольника на панели инструментов и выберите интересующую область.

Перейдите к изображению, затем нажмите «Обрезать», чтобы обрезать рентабельность инвестиций. Перейдите к анализу, затем нажмите установить масштаб. Во всплывающем окне введите 1.0 в поле соотношения сторон пикселей и установите микрометр в качестве единицы длины.

В поле «Расстояние в пикселях» введите ширину изображения в пикселях. В поле известного расстояния введите реальную ширину изображения в микронах. Чтобы измерить размер липосомы, с помощью инструмента выделения овала на панели инструментов нарисуйте круг вдоль края липосомы.

Перейдите к анализу, затем нажмите «Измерить», чтобы измерить площадь круга, из которой можно вычислить диаметр липосомы. Успешная генерация липосом подтверждается визуализацией тонкого круглого кольца, которое является зеленым флуоресцентным липидным бислоем. Под 488 нанометровым лазером используют конфокальную микроскопию для подтверждения инкапсуляции флуоресцентного красителя.

Внутренняя среда липосом должна быть равномерно флуоресцентной под 647-нанометровым лазером. Образование липосом может быть визуализировано тонкими зелеными круглыми кольцами. Восстановленный аффект в сетях внутри липосом неоднороден, проявляясь в виде разветвленных сетевых структур актиновых нитей.

Отраслевая архитектура была вызвана введением ARP двух трех комплексов, который одновременно управляет нуклеацией и ветвлением актиновых нитей вместе с VCA HEZ. Тонкий, но густо разветвленный актиновый слой создается на внутренней створке бислоя липосом, который можно визуализировать как флуоресцентный. Липидная звуковая конечная буферная смесь обычно должна перекачиваться вперед и назад через стеклянный шприц, чтобы избежать попадания пузырьков воздуха.

Смесь должна быть беловатой после обработки. Эта методика проложила путь к построению минимальной модели клетки, лишенной сложных биохимических норм. С помощью этой системы, имитирующей клетки, исследователи могут исследовать механические и динамические свойства белков цитоскелета, нуклеатора и молекулярного двигателя.