Стабильно установленная двухточечная инъекция лизофосфатидилхолин-индуцированной модели фокального демиелинирования у мышей
11 мая 2022 г.
Настоящий протокол описывает двухточечную инъекцию лизофосфатидилхолина через стереотаксическую рамку для создания стабильной и воспроизводимой модели демиелинизации у мышей.
Наша модель очень актуальна для демиелинических заболеваний, особенно рассеянного склероза. И это может способствовать соответствующему продвижению клинически значимых исследований. Это подробный протокол, который может непосредственно вызвать тяжелую демиелинизацию быстро и стабильно у мышей с помощью хирургической процедуры.
Пробуя эту технику в первый раз, будьте терпеливы и убедитесь, что координаты точны. Начните с подключения иглы 32-го калибра к 5-микролитровому шприцу. Выводят 5 микролитров раствора LPC для приготовления инъекции.
Далее подтвердите глубину анестезии мыши отсутствием рефлекса защемления пальцев ног при гладком дыхании. Поместите мышь в стереотаксическую рамку спинной стороной вверх и закрепите голову носовым конусом и зубным зажимом. Прикрепите мышь к стереотаксическому аппарату с помощью двусторонних ушных вкладышей.
Убедитесь, что ушные вкладыши ровные, а голова горизонтальная и устойчивая. Дезинфицируйте кожу головы, протирая йодофором. Затем используйте скальпель, чтобы разрезать небольшой разрез примерно до 1,5 сантиметров вдоль средней линии кожи головы, чтобы обнажить череп.
Протрите навык ватным тампоном, смоченным в 1% перекиси водорода, пока не обнажаются брегма, лямбда и задний родничок. Поместите шприц на стереотаксический аппарат. Обеспечьте горизонтальное расположение головы животного и найдите мозолистое тело.
Как только место инъекции определено, запишите координаты и сделайте отметку маркером на черепе. Аккуратно просверлите отмеченный участок с помощью сверла черепа. Позаботьтесь о том, чтобы избежать кровотечения.
Медленно перемещайте иглу к заданным координатам. Чтобы индуцировать демиелинизацию мозолистого тела, вводят 2 микролитра раствора LPC в каждое место инъекции со скоростью 0,4 микролитра в минуту. После инъекции держите иглу в каждом месте в течение дополнительных 10 минут.
Наконец, зашить кожу швом 4-0 и подождать, пока животное проснется в течение 10 минут. Репрезентативное изображение показывает обнаружение легионов белого вещества с помощью быстрого синего окрашивания Luxol. Из результатов стабильная демиелинизация мозолистого тела может наблюдаться через 10 и 28 дней после инъекции.
Здесь показана количественная оценка области демиелинизации в разные моменты времени. Благодаря иммунофлуоресцентному окрашиванию деградировавшего основного белка миелина наблюдалось заметное увеличение dMBP в группе, вводимой LPC через 10 дней после инъекции, что представляет собой потерю миелина в мозолистом теле. Вестерн-блоттинговый анализ экспрессии основного белка миелина, или MBP, показал значительную потерю MBP после инъекции LPC.
Бета-актин использовался в качестве регулятора нагрузки для измерения базового выражения. Изображения электронной микроскопии подтверждают миелинизированную ультраструктуру в мозолистом теле фиктивной группы и LPC-инъекционной группе. GST-pi является маркером созревания клетки-предшественника олигодендроцитов, или OPC, дифференцировки.
После 10 дней инъекции LPC GST-pi снизился по сравнению с фиктивной группой. В то же время пролиферационная способность олигодендроцитов может отражаться соотношением пролиферированных олигодендроцитов и общего количества клеток линии олигодендроцитов. Более высокое соотношение представляет собой большую пролиферацию олигодендроцитов через 10 дней после инъекции.
Репрезентативные изображения показывают плавательную дорожку мышей в каждой группе, в присутствии платформы и после снятия платформы. Результаты показывают, что пространственная память демиелинизированных мышей значительно нарушена в двухточечной модели инъекции LPC. При попытке этой процедуры убедитесь, что скорость инъекции точна, и держите иглу в каждом месте в течение дополнительных 10 минут.
Просмотрите полный транскрипт и получите доступ к тысячам научных видео
Обзор
В данном протоколе подробно описана процедура двухточечного введения лизофосфатидилхолина (LPC) с использованием стереотаксической рамы для создания стабильной модели демиелинизации у мышей. Представленный метод актуален для изучения демиелинизирующих заболеваний, в частности рассеянного склероза, и позволяет исследовать механизмы и последствия демиелинизации.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Нейробиология
- Исследование демиелинизации
- Мышиные модели заболеваний
Теоретические основы
- Понимание процессов демиелинизации имеет решающее значение для разработки методов лечения таких заболеваний, как рассеянный склероз.
- Описанная процедура предназначена для индуцирования быстрой и воспроизводимой демиелинизации в лабораторных условиях.
- Точность хирургической техники имеет важное значение для успеха данной процедуры.
- Для оценки модели используются такие методы гистологического анализа, как окрашивание люксолом быстрого синего (Luxol fast blue).
Цель исследования
- Создать надежную модель для изучения механизмов демиелинизации.
- Обеспечить возможность исследования потенциальных терапевтических методов лечения состояний, связанных с демиелинизацией.
- Предоставить детальные хирургические протоколы, позволяющие получить количественно оцениваемые результаты.
Используемые методы
- Модель предполагает использование стереотаксического хирургического подхода для инъекций LPC.
- Мышам вводят раствор LPC в точные анатомические области, в частности, прицельно в мозолистое тело.
- Каждая инъекция представляет собой введение 2 µl LPC с контролируемой скоростью.
- Послеоперационные обследования на 10-й и 28-й дни позволяют получить основные показатели результатов.
- Для анализа потери миелина применяются такие гистологические методы, как иммунофлуоресценция и вестерн-блоттинг.
Основные результаты
- Была достигнута стабильная демиелинизация мозолистого тела, что подтверждалось гистологическим окрашиванием в нескольких временных точках.
- Посредством различных анализов было подтверждено увеличение маркеров, указывающих на потерю миелина.
- Поведенческие тесты выявили значительные нарушения пространственной памяти после демиелинизации.
- Результаты указывают на изменения в пролиферации и дифференцировке олигодендроцитов в ответ на воздействие LPC.
Выводы
- В данном исследовании была успешно создана модель для изучения динамики демиелинизации и возможных терапевтических стратегий.
- Полученные результаты позволяют глубже понять нейронные механизмы, лежащие в основе демиелинизации, и роль олигодендроцитов.
- Эта модель может способствовать более глубокому пониманию рассеянного склероза и аналогичных состояний.
Часто задаваемые вопросы
Практическая значимость для промышленности
Стабильно установленная модель двухточечного введения LPC обеспечивает быструю и воспроизводимую индукцию очаговой демиелинизации у мышей, что непосредственно способствует исследованиям на этапе поиска новых средств при демиелинизирующих заболеваниях, таких как рассеянный склероз. Данная модель представляет собой надежную платформу для изучения механизмов патогенеза, валидации мишеней и количественной оценки потери и восстановления миелина. Ее воспроизводимость и количественные показатели делают ее критически важным инструментом для доклинической оценки и приоритизации портфеля препаратов при нейровоспалительных заболеваниях.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Ранние этапы поиска и валидация мишени
- Позволяет изучать механизмы демиелинизации и участие различных путей в патогенезе заболеваний в релевантных системах.
- Обеспечивает функциональную валидацию мишеней путем количественного определения потери миелина и анализа ответов олигодендроцитов.
- Повышает прогностическую достоверность при проверке терапевтических гипотез при нейровоспалительных состояниях.
Скрининг и разработка анализа
- Обеспечивает валидированную систему in vivo для последующего скрининга соединений, направленных на ремиелинизацию или нейропротекцию.
- Обеспечивает стандартизированную, воспроизводимую демиелинизацию, подходящую для количественного гистологического анализа и поведенческих тестов.
- Позволяет проводить надежную оценку потенциальных методов вмешательства с измеримыми конечными точками.
Трансляционные и доклинические исследования
- Соответствует патологическим изменениям, характерным для рассеянного склероза, что способствует разработке трансляционных биомаркеров.
- Обеспечивает преемственность процесса — от выявления механизмов до доклинической валидации терапевтических стратегий.
- Снижает биологические риски за счет моделирования острого демиелинизирующего процесса и функциональных нарушений in vivo.
Интеграция конвейеров и рабочих процессов
Данная модель интегрируется в континуум от открытия до доклинических исследований, связывая ранние механистические исследования с трансляционными исследованиями демиелинизирующих заболеваний.
- Открывающая биология: обеспечивает проверку гипотез и уточнение сигнальных путей посредством количественного анализа демиелинизации и олигодендроцитов.
- Скрининг: предоставляет воспроизводимые результаты, готовые для анализа, для оценки соединений и исследований зависимости «доза-эффект».
- Аналитика: позволяет осуществлять количественное измерение потери миелина, экспрессии белков и поведенческого дефицита для сравнительного анализа.
- Трансляционные исследования: моделирует конечные точки, релевантные заболеванию, для согласования биомаркеров и доклинической валидации.
- Корпоративное повторное использование: предлагает стандартизированную, многократно используемую платформу in vivo для различных программ исследований нейровоспаления.
Операционное и организационное воздействие
- Научная ценность: повышает прогностическую достоверность и снижает механистическую неопределенность в исследованиях демиелинизации.
- Операционная ценность: обеспечивает стандартизированное, воспроизводимое и масштабируемое моделирование in vivo для использования в различных программах.
- Стратегическая ценность: улучшает процесс принятия решений о продолжении или прекращении разработки (go/no-go) и эффективность использования капитала за счет предоставления надежных доклинических данных.
- Влияние на портфель: позволяет проводить приоритезацию и продвижение активов по лечению нейровоспалительных заболеваний с учетом рисков.
Особенности реализации
- Требуется опыт проведения стереотаксических операций и точного анатомического наведения на мишенях у мышей.
- Необходим доступ к инфраструктуре для гистологического анализа, иммунофлуоресценции и поведенческого анализа.
- Для обеспечения воспроизводимости требуется стандартизация координат и скорости введения препарата между всеми группами исследователей.
- Адаптация метода для других областей ЦНС или моделей заболеваний может потребовать оптимизации протокола.
- Данная модель в первую очередь отражает острую демиелинизацию; исследования хронических процессов или ремиелинизации могут потребовать дополнительной валидации.
