Крупномасштабный гравитационный анализ личинок Caenorhabditis Dauer

Этот высокопроизводительный анализ может быть использован для наблюдения за устойчивым гравитактическим поведением у личинок caenorhabditis dauer. Поведение червей наблюдается на больших расстояниях по сравнению с анализами, выполняемыми на чашке Петри. Это повышает чувствительность анализа и позволяет проводить детальный анализ данных.

Изучение поведения гравитаксиса может дать представление о том, как гравитационное ощущение происходит при канорхабдите, что имеет отношение к пониманию вестибулярной системы млекопитающих. Создание камер гравитаксиса, изоляция дауэров и введение червей в камеры требует практики. Вы можете сэкономить время, изолировав дауэры и создав камеры за день вперед.

Начните с установки горелки Бунзена, от одного до двух лезвий бритвы, плоскогубцев, пинцетов, пластиковой режущей поверхности и вытяжного капюшона. Чтобы сделать камеру, соберите две 5-миллилитровые серологические пипетки, а пинцетом снимите хлопчатобумажную пробку с одной пипетки. Держите лезвие бритвы плоскогубцами над горелкой Бунзена до горячего состояния.

Используйте нагретое лезвие, чтобы отрезать конический конец второй пипетки так, чтобы вся пипетка имела равномерный диаметр. Теперь быстро поднесите два модифицированных конца пипетки близко к пламени и слегка расплавите их. Соедините эти концы, крепко прижав их друг к другу, гарантируя, что стенки обеих пипеток непрерывны.

Если после соединения видны какие-либо пробелы, разбейте их на части и повторите этот шаг. Приготовьте NGM с 4%-агаром в соответствии со стандартными процедурами для червей и заполните каждую камеру, прикрепив ее к серологическому пипетке, пока агар еще расплавлен. Чтобы свести к минимуму любые изменения консистенции агара из-за неравномерного охлаждения, держите пипетку параллельно столешнице при вытягивании агара.

Затем медленно вытяните раствор и запечатайте наконечник парапленкой перед извлечением камеры из трубоукладчика. Положите камеру плоско, чтобы остыть, и дайте агару затвердеть перед перемещением. После охлаждения нагрейте трехмиллиметровый шестигранный ключ над горелкой Бунзена и создайте небольшое пластиковое отверстие, плотно вдавливая его в стенку каждой камеры примерно на пять миллиметров к одной стороне средней линии.

Затем используйте нагретое лезвие, чтобы удалить хлопчатобумажные и конические концы камеры и запечатать концы парафиновой пленкой. За 10-15 дней до эксперимента разложите каждый штамм на две-три большие пластины NGM с бактериями OP50 и оберните парафиновую пленку. Собирайте червей, промыв крышки и пластины с помощью буфера M9 и пипетки раствора в 15-миллилитровые центрифужные трубки.

Гранулируйте червей, вращаясь при 1600 x G в течение 30-60 секунд при комнатной температуре, и аспирируйте большую часть буфера M9 пипеткой или вакуумным аспиратором. Добавьте семь миллилитров 1% раствора додецилсульфата натрия в каждую гранулу червя и оставьте червей в ней на 30 минут. Чтобы обеспечить аэрацию, продолжайте непрерывно вращать трубки в течение этого времени.

Затем удалите моющее средство, промыв его три-пять раз С M9. После добавления пяти миллилитров М9 добавляют пять миллилитров холодного фильтрованного 60%-ного раствора сахарозы. Тщательно перемешайте и создайте градиент разделения путем центрифугирования при 1600 x G в течение пяти минут при комнатной температуре. Заполните новые 15-миллилитровые центрифужные трубки двумя миллилитрами M9 Buffer.

Теперь раздавите концы стеклянных пипеток Пастера, чтобы расширить отверстие. И используйте эти пипетки для переноса верхнего слоя раствора с градиента сахарозы на новые трубки. Промойте дауэры три-пять раз с помощью буфера M9.

Центрифуги выдерживают при 1600 x G в течение пяти минут при комнатной температуре и аспирируют большую часть раствора M9 пипеткой или вакуумным аспиратором. Затем оцените плотность червя, вручную подсчитывая количество червей в трех отдельных каплях по 1 микролитр под рассекающим микроскопом, и используйте среднее значение этих подсчетов для аппроксимации количества червей на микролитр. Теперь расширьте отверстие наконечника, разрезав конец наконечников пипетки объемом 10, 20 или 200 микролитров.

Установите микропипетку на немного больший объем, чем предполагаемый объем аспирации. Аспирировать приблизительно 1-2 микролитра концентрированного раствора червя и дать небольшому количеству воздуха проникнуть в наконечник. Осторожно вдавите наконечник пипетки в агар, одновременно нажимая на микропипетку.

Это позволит создать место инъекции, не засоряя наконечник. Отпустите червей в агар и используйте парафиновую пленку, чтобы запечатать отверстие. Чтобы устранить как можно больше переменных после того, как камеры помещены в темную клетку Фарадея при комнатной температуре, маркируйте каждую камеру и повесьте ее вертикально в клетку Фарадея.

Одновременное тестирование горизонтальных органов управления путем укладки некоторых камер в одинаковых условиях окружающей среды. Затем используйте вертикально ориентированные черви N2 в качестве положительного контроля и горизонтально ориентированные камеры, содержащие N2 dauers, в качестве дополнительного отрицательного контроля против экспериментальных штаммов. Через несколько часов черви dauer начинают рассеиваться от места старта и им требуется несколько часов, чтобы достичь любого конца камеры.

Оставьте камеры нетронутыми в течение этого времени и наберите в течение 12-24 часов после инъекции. Затем удаляйте камеры по одной и оценивайте гравитаксию, ища живых дауэров под рассекающим микроскопом и отмечая их местоположение чернилами. Не забивайте червей в пределах 2,5 сантиметров по обе стороны от места инъекции, так как эти черви вряд ли продемонстрируют направленное предпочтение.

Кроме того, избегайте забивания червей, которые кажутся мертвыми или попадают в ловушку в жидкости, и выбрасывайте любые камеры, содержащие более 50% мертвых или плавающих червей. Чтобы количественно оценить результаты, используйте маркер, чтобы разделить каждую половину камеры на семь 3,5 сантиметра, начиная с 2,5 сантиметров от места инъекции. Используйте ручной счетчик подсчета, чтобы подсчитать количество червей, наблюдаемых в каждом разделе.

При caenorhabditis briggsae большой процент червей dauer показал миграцию к верхней части камер. Тем не менее, горизонтальные элементы управления показали распределение вокруг центра камер, что указывает на отрицательное гравитактическое поведение. Кроме того, вертикальные распределения caenorhabditis briggsae и caenorhabditis elegans не показали никаких различий, предполагая, что caenorhabditis briggsae dauers демонстрируют отрицательное поведение гравитаксиса, похожее на caenorhabditis elegans dauers.

Паралитические агенты, такие как азид натрия, не используются в этом протоколе. Поэтому важно забить камеры гравитаксиса, как только они будут удалены из клетки Фарадея. Этот анализ привел к обнаружению негативного поведения гравитаксиса у c.elegans.

Путем тестирования нескольких мутантных штаммов он также выявил генетические и нейронные требования к гравитакси у червей.