Закупка и перфузионно-децеллюляризация васкуляризованных лоскутов свиней в индивидуальном перфузионном биореакторе

Этот метод описывает хирургическое получение трех васкуляризированных лоскутов свиней и их последующую перфузионную децеллюляризацию. Этот метод может помочь усилиям по регенерации свиных лоскутов с использованием подхода децеллюляризации и рецеллюляризации тканей. Основным преимуществом этого метода является его универсальность для достижения обильной децеллюляризации различных васкуляризированных свиных лоскутов в простой в сборке установке биореактора.

Метод, описанный здесь, может быть широко применен к другим васкуляризированным лоскутам в качестве потенциального решения тканевой инженерии с использованием свиных лоскутов в реконструктивной хирургии. Для начала сделайте трубку для притока и оттока, измеряя приблизительно 50 сантиметров силиконовой трубки lS16 с платиновым покрытием. Подключите один конец к желтой 3-ступенчатой насосной трубке, а другой к стерильной серологической пипетке объемом 2 миллилитра, чтобы перенести перфусат из резервуаров моющего средства в камеру биореактора.

Автоклав камеры и трубки в индивидуально упакованной стерильной упаковке. Для заготовки сальника поместите 12-недельную обезболенную йоркширскую свинью в лежачее положение, а затем подготовьте брюшко обычным стерильным способом. Выполните ксифо-пуповинную лапаротомию, чтобы войти в брюшную полость и мобилизовать цефаладу желудка, и поместите сальник в операционное поле.

Начиная с левого аспекта большей кривизны, где левая гастроэпиплоидная артерия соединяется со селезеночной артерией, скелетируют левую гастроэпиплоическую артерию и вену с помощью прямых ножниц тенотомии Стивенса. Затем обжарьте и разделите оба по отдельности с помощью хирургических стяжек или зажимов. Продолжайте вдоль большей кривизны желудка слева направо, чтобы сжать и разделить короткие сосудистые ветви, возникающие из сальника, обеспечивая большую кривизну желудка.

Продолжайте мобилизацию большого сальника до тех пор, пока не будет обнаружено соединение правых гастроэпиплоических сосудов и гастродуоденальной артерии. Затем разложите и разделите правую гастроэпиплоидную артерию и вену, чтобы освободить сальниковый лоскут и обеспечить каннуляцию лоскута позже. Для получения лоскута тензорной фасции лата поместите свинью в боковое пролежневое положение.

Отметьте внутреннюю границу лоскута от переднего верхнего подвздошного отдела позвоночника, или ASIS, к боковой надколеннике и заднюю границу примерно от 8 до 10 сантиметров каудально. Используйте скальпель, чтобы сделать резкий разрез в дистальном крае на надколеннике. Углубите разрез через подкожные ткани, чтобы достичь фасции, покрывающей прямую феморию, и продолжайте разрезы в сторону ASIS вдоль отмеченных границ.

Чтобы изолировать только фасциальный лоскут, удалите вышележащий компонент кожи из подлежащего слоя фасции. Затем прижигают или прижигают мелкие перфораторные сосуды к коже. Вернитесь к дистальной границе лоскута и прорежьте глубокую фасцию.

Мобилизуйте фасцию от лежащей в основе мышцы vastus lateralis в сторону ASIS. Проследив ножку по направлению к глубоким бедренным сосудам, скелетируйте боковую циркумфлексную бедренную артерию и вену, снабжающую фасциальный лоскут. Затем обжигают и делят лоскутные сосуды проксимально, где они соединяются с глубокими бедренными сосудами и позволяют впоследствии канюляцию.

Для приобретения лучевого клапана предплечья отметьте квадрат размером 3 на 3 сантиметра на радиальном аспекте расширенного предплечья свиньи. Проведите линию между средней точкой проксимального края лоскута и антекубитальной ямкой, чтобы обозначить приблизительное течение ножки лучевой артерии. Подтверждают артериальное течение пальпацией.

Далее разрезаем кожу с помощью скальпеля в дистальном аспекте с глубиной до антебрахиальной фасции. Тупой рассечен тенотомическими ножницами до тех пор, пока не встретится дистальная лучевая артерия и ее комитанты. Затем обжаривают и разделяют артерию и вены хирургическими завязками или клипсами.

Продолжайте разрезы кожи на лучевом и локтевом краях отмеченного квадрата кожи. Затем мобилизуйте лоскут от подлежащей лучевой кости хирургическим лезвием или прижиганием, переходя от локтевого к радиальному направлению, одновременно поднимая кожный лоскут проксимально к антекубитальной ямке. Используя ножницы для тенотомии, скелетируют лучевую артерию и вену comitantes проксимально в антекубитальной ямке, где они соединяют плечевую артерию и вены соответственно.

Рассекайте сосуды из окружающих фиброзно-жировых тканей, чтобы выделить сосудистую ножку. Затем разложите и разделите артерию и вену отдельно, чтобы освободить лучевой лоскут предплечья. Затем соедините сосуды ножки с помощью ангиокатетера 20-24-го калибра, закрепленного шелковыми завязками 3-0.

Промывайте гепаринизированный физиологический раствор в лоскутную артериальную канюлю до тех пор, пока не будет наблюдаться явный венозный отток. Во время работы в ламинарном проточном шкафу биобезопасности поместите лоскуты в тканевую камеру биореактора. Первичная приточная трубка со стерильным гепаринизированным физиологическим раствором для удаления остаточного воздуха и расположения створок, обеспечивающих соединение между артериальной канюлей лоскута и соединительным соединителем.

Затем используйте стерильные гемостаты, чтобы прикрутить артериальную канюлю к соединителю. Затем промывайте гепаринизированный физиологический раствор через запорный кран, чтобы убедиться, что соединение luer не имеет утечек, и что провалы могут быть перфузированы с признаками венозного оттока. После закрытия крышки тканевой камеры подключите приточную трубку с желтой 3-ступенчатой насосной трубкой к приточному запорному крану тканевой камеры.

Кроме того, прикрепите встроенный датчик давления к 3-позиционному запорному крану для контроля давления перфузии. Затем включите приточный перистальтический насос и на начальном экране перейдите к третьей вкладке с помощью стрелки, чтобы установить идентификатор трубки на 1,85 миллиметра. Затем установите скорость перфузии со второй вкладки.

Входная скорость в качестве режима подачи установлена на уровне 2 миллилитров в минуту. Убедитесь, что направление потока правильное, как показано на экране. Загрузите 3-ступенчатую насосную трубку в перистальтический насос с помощью совместимой кассеты.

Установите настройку оттокового насоса на скорость 4 миллилитра в минуту. Соедините отточную трубку с желтой 3-ступенчатой насосной трубкой с выходным запорным краном тканевой камеры. Затем загрузите 3-ступенчатую насосную трубку в перистальтический насос и запустите поток для обоих насосов, нажав кнопку питания на каждом насосе.

Начинают перфузионную децеллюляризацию лоскутов гепаринизированным физиологическим раствором в тканевой камере в течение 15 минут, чтобы удалить любые оставшиеся сгустки крови. По завершении замените остаточный физиологический раствор 500 миллилитрами додецилсульфата натрия или SDS, раствором для децеллюляризации, чтобы погрузить лоскут. Далее перекладывают приточную трубку в раствор SDS и обливают ткань.

После децеллюляризации SDS аспирируйте оставшиеся SDS перед перфузией лоскута PBS в течение одного дня. После перфузионной децеллюляризации SDS последовательно перфузируйте лоскуты в растворе ДНК в течение двух часов, а затем в PBS в течение одного дня, с последующим переносом приточной трубки в перуксусную кислоту и этанол в дистиллированной воде для стерилизации лоскутов путем перфузии в течение трех часов. После этого удалите лоскуты асептически и погрузите их в две промывки PBS, содержащие 1% антибиотики антимикотиков в течение 15 минут каждая.

Храните лоскуты при температуре 4 градуса Цельсия до готовности к рецеллюляризации. Используйте инструмент для пунш-биопсии от 3 до 10 миллиметров для получения образцов тканей для оценки децеллюляризованных лоскутов. Изолированные децеллюляризированные лоскуты, промытые под ручным управлением, продемонстрировали признаки оттока из свободно дренирующей венозной канюли сальника, тензорной фасции лата и радиального клапана предплечья.

Грубая морфология нативного сальника, тензорной фасции лата и радиальных лоскутов предплечья казалась розового цвета сразу после закупки. Для сравнения, децеллюляризированные ткани были характерно белыми или непрозрачными по внешнему виду. Гистологическое исследование нативных тканей с гематоксилином и эозином показало наличие синих ядер.

В децеллюляризованных лоскутах гистологическое окрашивание выявило потерю клеточного материала без синего ядерного окрашивания, что указывает на бесклеточный каркас ткани. Дополнительная количественная оценка содержания ДНК показала значительное снижение ДНК в бесклеточных каркасах по сравнению с нативными тканями. Наиболее важным соображением является хирургическая техника, используемая во время закупок, заботящаяся о том, чтобы избежать повреждения лоскутной ножки, чтобы обеспечить последующую перфузионную децеллюляризацию.

После перфузионной децеллюляризации полученные лоскуты могут быть рецеллюляризированы с тканеспецифическими клеточными популяциями для регенерации нативных тканевых компартментов.