Закупка и децеллюляризация задних конечностей крыс с использованием биореактора ex vivo на основе перфузии для васкуляризированной композитной аллотрансплантации

Мы создали модель маленького животного для децеллюляризации конечности. Это полезно для облегчения исследования концепции де и рецеллюляризации васкуляризированных композитных тканей. Схемы иммуносупрессии являются одним из основных ограничений в васкуляризированной композитной аллотрансплантации.

Иммуногенность тканей может быть снижена с помощью децеллюляризации. Для начала сделайте разрез кожи с помощью хирургического лезвия no 10 вдоль паховой связки, двигаясь от бокового к медиальному направлению, при этом удерживая окружающую кожу щипцами Адсона. Когда основной жир обнажается, используйте тупое рассечение, чтобы тщательно рассечь жир и найти верхние эпигастральные сосуды.

Используя микроножницы, рассекните проксимально и обнажите подлежащий бедренный нерв, артерию и вену на уровне паховой связки. Под рассеченным микроскопом идентифицируют бедренные сосуды, а также рассекают артерию и вену проксимально с помощью тонких щипцов для получения достаточной длины от точек бифуркации артериальной сети. Затем перевязать бедренную вену и артерию отдельно, используя 6-0 швов.

Затем проведите окружное рассечение вокруг остальной части задней конечности, не нарушая перевязанные бедренные сосуды, и переведите бедренную кость средней длины с помощью костяного резака. Чтобы полностью изолировать заднюю конечность, трансектируйте перевязанные бедренные сосуды, дистальные к лигатурам с помощью микроножек, и канюлируйте бедренную артерию с помощью ангиокатетера 24 калибра под рассеченным микроскопом. Затем промыть гепаринизированным физиологическим раствором до тех пор, пока не будет наблюдаться прозрачный отток из бедренной вены.

Закрепите канюлю, завязав один шов вокруг канюлированного сосуда в другом шве дистально вокруг самой канюли, гарантируя, что канюля размещена проксимально, чтобы предотвратить блокирование точек раздвоения. После этого погружайте закупленные задние конечности и PBS до децеллюляризации. Чтобы сконструировать биореактор, поместите стерилизованную камеру и вкрутите три одноразовых трехсторонних запорных крана на входе, выходе и линиях пополнения, гарантируя, что запорный кран для пополнения отверстия закрыт в оставшихся двух портах для предотвращения утечки.

Прикрепите ранее изготовленные силиконовые трубки к запорным кранам на входной и выходной линиях. Затем подключите перистальтические трубки к силиконовым трубкам. Закрепив кассету на перистальтической трубке, поместите ее на перистальтический насос.

Далее подключите одну из силиконовых трубок к концу перистальтической трубки выходной линии с шага выше. На другом конце соедините одну миллилитровую серологическую пипетку и повторно суспендируйте конец, прикрепленный серологической пипеткой, в колбу резервуара для отходов. Затем подвешиваем конец трубки, прикрепленной к серологической пипетке, в резервуар для моющего средства и немедленно запечатываем отверстие колбы резервуара моющего средства парапленкой.

Добавьте 0,25% SDS из литровой стеклянной банки в камеру биореактора на половине уровня. Затем возьмите закупленный задний налим с помощью щипцов Adson и осторожно подвешивайте его в камере биореактора. Используя две пары щипцов Adson, направьте канюлированную часть задней конечности к входной линии, удерживая канюлю одной парой щипцов.

Используйте другую пару щипцов, чтобы скрутить и закрепить впускную линию к канюле. После закрепления добавьте еще 0,25% SDS из однолитровой стеклянной банки, чтобы полностью погрузить конечность по мере необходимости, гарантируя, что выходной порт также погружен в резервуар биореактора и поддерживается постоянный отток. Затем прикрепите одноразовый шприцевой фильтр к вентиляционному отверстию на крышке камеры биореактора и закрепите крышку на биореакторе, гарантируя, что камера герметизирована со всех сторон.

Чтобы удалить воздух из трубки и загрунтовать перфузионный контур, используйте новый одноразовый шприц объемом 10 миллилитров для извлечения моющего средства из резервуара моющего средства с помощью трехстороннего запорного крана на входной линии. После рисования используйте ту же жидкость для вставки в трехсторонний запорный кран на выходной линии. Затем прижмите и закрепите кассеты трубкой в перистальтическом насосе.

Затем включите перистальтический насос с помощью кнопки питания. На экране перистальтического насоса перейдите ко второй вкладке с помощью клавиши стрелки, чтобы установить скорость перфузии для первого канала с входным расходом в качестве способа подачи, и установите скорость перфузии на уровне одного миллилитра в минуту, гарантируя, что направление потока является правильным в соответствии с настройкой устройства. Откалибруйте перистальтический насос, чтобы обеспечить количество жидкости, подаваемой через впускную линию и/или взятой из выходной линии, последовательно перетекающей между ними, гарантируя, что идентификатор трубки установлен на 1,85 миллиметра.

Начните децеллюляризацию с помощью перфузии машины со скоростью один миллилитр в минуту как для входной, так и для выходной линий, нажав кнопку питания на клавиатуре. Контролируйте и следите за тем, чтобы поток был и продолжался как на входной, так и на выходной линиях. Используя 1 литр 0,25% STS, пополняйте резервуар биореактора через пополняющий порт по мере необходимости.

Затем ищите белый полупрозрачный вид ткани, который появится к пятому дню, что указывает на децеллюляризацию задних конечностей крысы. После подтверждения децеллюляризации замените резервуар моющего средства на PBS и 1% антибиотико-антимикотический резервуар и запечатайте отверстие колбы парапленкой. Начинают PBS и 1% антибиотико-антимикотическую перфузию со скоростью один миллилитр в минуту, и продолжают в течение двух дней.

Замените PBS и 1% антибиотик-антимикотический резервуар 200 миллилитрами 0,1% паразитарной кислоты, резервуаром этанола 4% и начните перфузию со скоростью один миллилитр в минуту в течение двух часов. Под шкафом биобезопасности отсоедините заднюю конечность от впускной линии, используя две пары стерильных щипцов Адсона, причем одна пара щипцов скручивает впускную линию, а другая удерживает канюлю, гарантируя, что канюля не вытягивается для предотвращения деканнуляции. Храните конечность в стеклянной банке емкостью 500 миллилитров, содержащей PBS, и 1% антибиотик-антимикотический при 4 градусах Цельсия до дальнейшего использования.

Как децеллюляризированная бедренная артерия, так и вена показали потерю ядерного содержимого во всех слоях и окружающей соединительной ткани, учитывая отсутствие синих окрашенных ядер, иначе присутствующих в родных сосудах. Оболочка intima media и адвентиция как бедренной вены, так и артерий поддерживались в децеллюляризованных сосудах. Бедренный нерв показал сохранение структуры тканей, в том числе эндоневриума.

Кость показала общую структурную задержку с потерей окрашенных ядер остеоцитов, а также из окружающих слоев эндостеи и надкостницы после децеллюляризации. Кожа показала потерю клеток из эпидермиса и дермы. Дерма показала сохраненные коллагеновые волокна, похожие на нативную ткань кожи.

Наконец, поперечный вид скелетных мышц показал потерю ядер, расположенных на периферии эндомизия. Содержание миофибрила оставалось сохраненным в соответствующих фасцикулах после децеллюляризации. Также была выполнена количественная оценка ДНК с использованием PicoGreen, где содержание ДНК было значительно снижено в бедренных сосудах, нервах, коже, мышцах и костях.

Следуя этому протоколу, децеллюляризированная конечность может быть дополнительно охарактеризована. Это включает в себя исследование внеклеточного матрикса с использованием как гистологических, так и биохимических методов, а также путем оценки сосудов с использованием визуализации. Децеллюляризованный ствол также может быть реклекулирован с использованием тканеспецифических клеток.