Полевое развертывание Candidatus Liberibacter asiaticus Detection с использованием амплификации полимеразы рекомбиназы в сочетании с CRISPR-Cas12a

Хуан Лонг Бин, сокращенно HLB. Это разрушительная болезнь цитрусовых во всем мире. В большинстве стран-производителей цитрусовых, таких как Китай и США, HLB вызывается бактериями, ограниченными флоэмой, Candidatus Liberibacter asiaticus, сокращенно CLas.

Раннее выявление CLas имеет важное значение для производителей, способствующих раннему вмешательству и предотвращению распространения болезни. Поэтому здесь мы разработали новый метод быстрой и портативной диагностики HLB, в сочетании с рекомбиназной полимеразной амплификацией и системой CRISPR-Cas12a. Мы назвали его CLas-DETECTR.

Чувствительность нашей платформы намного выше, чем у ПЦР. Кроме того, он показывает аналогичный результат с qPCR, когда использовались образцы листьев. По сравнению с обычными обнаружениями CLas, наш метод может быть завершен за 90 минут и работает в изотермическом состоянии.

Результат также может быть визуализирован с помощью портативного флуоресцентного устройства обнаружения в полевых условиях. CLas-DETECTR содержит четыре этапа: приготовление раствора, полная изоляция ДНК цитрусовых, изотермическая амплификация ДНК и результаты визуализации. Схема анализа CLas-DETECTR проиллюстрирована здесь.

Буфер A, раствор B и раствор C готовятся так, как описано в протоколе. Чтобы сэкономить время и сделать этот метод пригодным для обнаружения полевых CLas, для получения сырых растительных экстрактов для амплификации ДНК был использован подход на основе полиэтиленгликоля E.coli. В средстве используются листья цитрусовых.

Выбейте несколько кусочков листовых дисков из листа. Поместите листовые диски в 1,5-миллилитровую трубку Эппендорфа. Затем добавьте 200 микролитр буфера А в трубку.

Измельчите листовые диски до однородной массы с помощью пластикового стержня вручную. Оставьте тюбик нетронутым в течение 10 минут. Супернатант впоследствии применяют для амплификации ДНК.

Для изотермической амплификации ДНК добавьте один микролитр супернатанта со стадии 2.3 и один микролитр ацетата магния в раствор B и хорошо перемешайте. В лаборатории инкубируют их в простом инкубаторе при 37 градусах в течение 15 минут. Чтобы визуализировать результаты, добавьте 10 микролитров смеси со стадии 3.2 в раствор С и хорошо перемешайте.

Высиживайте их в инкубаторе 37 градусов в течение 60 минут. Наденьте очки и наблюдайте за зеленым флуоресцентным сигналом через портативное флуоресцентное устройство обнаружения. Для проверки специфичности CLas-DETECTR используются первые чистые колонии Agrobacterium tumefaciens GV3101, Xanthomonas citri subsp.

Citri, который является патогеном цитрусовой язвы и штамма Burkholderia stabilis 1440, выделенных в нашей лаборатории, были использованы для извлечения их геномной ДНК. Затем эти три бактерии геномной ДНК и CLas-положительная геномная ДНК листьев Ньюхолла были подвергнуты тесту CLas-DETECTR. Для проверки чувствительности CLas-DETECTR была обнаружена серия разбавлений фрагментов ДНК CLas с использованием PCR, CLas-DETECTR и qPCR, как описано в протоколе После теста на специфичность и чувствительность был использован метод CLas-DETECTR для обнаружения присутствия CLas в поле.

Образцы листьев, собранные из сладкого апельсинового дерева Ньюхолла, выращенного в питомнике ресурсов зародышевой плазмы в кампусе Ганнаньского педагогического университета, Цзянси, Китай. qPCR, убедительный метод обнаружения CA, обычно используемый в лаборатории, также был применен. Образцы листьев из HLB-инфицированного и HLB-неинфицированного дерева Ньюхолла, в которых присутствие CLas было подтверждено в нашей лаборатории, были подвергнуты тесту CLas-DETECTR.

Зеленый флуоресцентный сигнал был захвачен в образце, инфицированном HLB, но не в HLB-неинфицированном и отрицательном контроле. Мы определили специфичность CLas-DETECTR с помощью нуклеиновых кислот, извлеченных из других бактерий. В анализе CLas-DETECTR только гДНК, извлеченная из CLas-положительных листьев Ньюхолла, продемонстрировала зеленые флуоресцентные сигналы.

гДНК, извлеченная из Agrobacterium tumefaciens GV3101, Xanthomonas citri subsp. citri и Burkholderia stabilis штамма 1440, этого не сделала, что означает, что CLas-DETECTR может специфически обнаруживать CLas. Мы также проверили чувствительность CLas-DETECTR с использованием серии разбавлений ДНК CLas, перечисленных в протоколе.

ПЦР может обнаружить 201 копию на мегалитр. С другой стороны, CLas-DETECTR может обнаруживать 2,01 копии на мегалитр, что свидетельствует о его доступности в качестве чувствительной полевой диагностики. qPCR может обнаруживать 0,201 копии на мегалитр, а значение Ct выше 36.

Таким образом, CLas-DETECTR на два порядка более чувствителен, чем традиционная ПЦР, и на один порядок менее чувствителен, чем qPCR, когда использовались разбавленные специфические ампликоны CLas. Наконец, пересмотрена осуществимость CLas-DETECTR для полевых образцов и проведено сравнение его чувствительности с qPCR. В цифрах мы видим.

Мы видим, что значение Ct выше 36, когда концентрация CLas составляет менее 0,2 копий на мегалитр, что является очень низкой концентрацией. Среди 15 образцов значение Ct образцов 1, 2, 3, 4, 8, 10, 13 и 14, обнаруженных qPCR, было менее 36. Наблюдались явные зеленые флуоресцентные сигналы.

С другой стороны, когда значение Ct образцов 6, 7, 9, 12 и 15, обнаруженных qPCR, было неопределенным, зеленых флуоресцентных сигналов не наблюдалось. Кроме того, слабые зеленые флуоресцентные сигналы наблюдались, когда значение КТ образцов 5 и 11, обнаруженных qPCR, было выше 36. Результаты будут свидетельствовать о том, что наша платформа является быстрым, надежным и чувствительным инструментом для диагностики HLB в полевых условиях.