Экспериментальная модель иммунотерапии меланомы с использованием вакцинации против опухоли с помощью кроветворного цитокина

Этот протокол обеспечивает клиническую модель иммунотерапии солидных опухолей и исследовательскую платформу для изучения взаимосвязи между опухолевыми клетками и инфильтрирующими иммунными клетками. Эта клеточная опухолевая вакцина удобна, проста в использовании и может сочетаться с другими терапевтическими методами, такими как блокада контрольных точек, для достижения аддитивного или синергетического эффекта, который может привести к более мощному и высокому опухолевому иммунитету. В демонстрации процедуры будет помогать Энн Баланцио, техник-исследователь из моей лаборатории.

Для начала культивируем клетки меланомы B16-F10 в IMDM, содержащие 10% теплоактивного FBS, 2 миллимоляра глутамина, 1 миллимоляр пирувата натрия, 1 миллимоляр MEM заменимых аминокислот и по 100 единиц на миллилитр пенициллина и стрептомицина. Поддерживайте клеточную линию на уровне 37 градусов по Цельсию с 5% углекислого газа. Посейте и соберите урожай клеток B16-F10, как описано в текстовой рукописи.

Удалите питательную среду и промыть колбы один раз PBS. Аспирировать PBS и добавить 5 миллилитров 0,25% трипсина-ЭДТА с последующим резким постукиванием по ободу колбы культуры. Добавьте 15 миллилитров питательной среды для нейтрализации трипсина-ЭДТА и перелейте содержимое колбы в 50-миллилитровую центрифужную трубку.

Вымойте поверхность посуды 10 миллилитрами PBS и перелейте в ту же 50-миллилитровую центрифужную трубку. Центрифугируйте клетки в течение 5 минут при 200 RCF. Выбросьте супернатант и разбейте гранулу ячейки пальцем, постукивая по дну трубки.

Добавьте холодные 10 миллилитров PBS и аккуратно пипетку клеточной суспензии. Затем вручную подсчитывают клетки с помощью гемоцитометра. Держите клетки на льду перед инъекцией.

Внутрикожно имплантировать 500 000 клеток опухолевых клеток B16-F10 в 50 микролитрах холодного PBS в левом боку, используя иглу 30 калибра. Доза имплантированных опухолевых клеток B16-F10 может потребоваться скорректировать в диапазоне от 50 000 до 500 000 клеток для успешного развития опухоли. После внедрения измеряют длину и ширину опухоли три раза в неделю с помощью электронного цифрового суппорта.

Рассчитайте объем опухоли и обработайте мышей опухолевой вакциной, когда опухоли достигли размера в два миллиметра, как описано в текстовой рукописи. Используя рентгеновский облучатель, установленный на 160 киловольт и 25 миллиампер, облучают клетки на 150 серых доз гамма-лучей. Подсчитайте и проверьте жизнеспособность клеток, окрашивая их в синий цвет перед инъекцией.

Внутрикожно вводите мышам 1 миллион облученных клеток B16-Flt3L в 50 микролитрах холодного PBS на том же фланге, что и первоначальная имплантация опухоли. Примерно в одном сантиметре от места первичной опухоли на 3, 6 и 9 день после первоначальной имплантации клеток. Пометьте места инъекций вакцины цветной ручкой, чтобы отличить их от первичной опухоли.

Если изначально было имплантировано 50 000 клеток B16-F10, рекомендуется проводить лечение вакциной на 8, 11 и 14 день. Хирургическим путем удалили опухоль с кожей у каждой усыпленной мыши и поместили ее в 24-луночную пластину с 1 миллилитром 10%-ной среды FBS RPMI 1640. Разрежьте опухоли на мелкие кусочки в двух миллилитрах буфера пищеварения и высиживайте в течение 25 минут при 37 градусах Цельсия.

Добавьте 10 миллилитров 10%-ной среды FBS RPMI 1640, чтобы остановить пищеварение. Перенесите клетки на 40-микрометровый клеточный сетчатый фильтр с помощью серологической пипетки объемом 25 миллилитров. Затем используйте поршень из одного миллилитра шприца для измельчения тканей.

Центрифугируйте клетки при 500 RCF в течение 5 минут при 4 градусах Цельсия. Повторно суспендируют гранулу в 5 миллилитрах 40%-ной градиентной удельной среды в PBS, разбавленной до 1x концентрации. Медленно добавляйте клеточную суспензию поверх 5 миллилитров 80%-ной градиентной удельной среды, содержащей PBS.

Центрифуга к ячейкам при 325 RCF с низкой настройкой тормоза в течение 23 минут при комнатной температуре. После центрифугирования тщательно соберите слой лейкоцитов на границе раздела между 40% и 80% градиентной градиентной средой и пропустите его через 40-микрометровый клеточный сетчатый фильтр. Центрифугируйте клетки при 500 RCF в течение 5 минут при 4 градусах Цельсия.

Инкубируйте гранулу в двух миллилитрах буфера лизиса эритроцитов в течение пяти минут при комнатной температуре. После инкубации добавляют 10 миллилитров 10%-ной среды FBS RPMI 1640 для гашения буфера лизиса RBC. Центрифугируйте клетки при 400 RCF в течение 5 минут при 4 градусах Цельсия.

Повторно суспендируют клетки в 0,5 миллилитра 10%-ной среды FBS RPMI 1640 и подсчитывают общее количество клеток перед использованием для дальнейшего анализа. Соберите селезенку или дренирующие лимфатические узлы в качестве средств контроля для стратегии захвата подмножеств иммунных клеток с помощью анализа проточной цитометрии. Следуйте методу изоляции клеток, описанному в текстовой рукописи.

Видимая черная точка имплантированных клеток B16-F10 обычно наблюдалась на поверхности кожи примерно через три дня после имплантации опухоли. Мышей лечили опухолевой вакциной через три, шесть и девять дней после того, как опухолевый узелок достиг или превысил размер двух миллиметров. Значительное снижение роста опухоли наблюдалось в группе вакцинированных мышей примерно через две недели после имплантации опухоли.

Клетки, собранные из слоя лейкоцитов, содержали много опухолевых клеток, что затрудняло легкое определение популяции лимфоцитов. Поэтому спленоциты использовали параллельно, для правильного определения подмножеств внутриопухолевых иммунных клеток в анализе проточной цитометрии. Вместе с матрицей компенсации были построены стратегии cd103-положительного, CD11C-положительного DC, CD8-положительного, CD4-положительного и Treg.

Были также представлены репрезентативные данные о приобретенных счетах и частоте каждой группы населения. Внутриопухолевый CD103-положительный, CD11C-положительный DC у вакцинированных мышей, демонстрировал значительно повышенную экспрессию костимулирующего лиганда CD86. У вакцинированных мышей также наблюдалось увеличение опухоли, проникающей в CD8-положительные и CD4-положительные, Foxp3-отрицательные клетки, а также в CD8-положительных гранзим b-положительных и интерферон гамма-положительных CTL.

Держите достаточное расстояние между первичной опухолью и опухолевой вакциной. Это физическое разделение имеет решающее значение, чтобы избежать потенциального слияния между двумя опухолевыми имплантатами.