Визуализация субклеточной локализации белка в сердце с помощью иммуномаркировки, опосредованной квантовыми точками, с последующей просвечивающей электронной микроскопией

Определение субклеточной локализации белка имеет решающее значение для определения его надлежащей функции и механизмов, участвующих в ней. Этот метод может помочь нам визуализировать субклеточную локализацию белка на уровне ультраструктуры. Квантово-точечная иммуномаркировка более стабильна, устойчива к фотоотбеливанию, имеет собственные спектры излучения, дает высокую электронную плотность и демонстрирует более высокую эффективность и удержание на тканях с лучшим проникновением в ткани.

Несколько этапов процесса, то есть фиксация, травление, блокирование и оптимальная концентрация квантовых точек, являются сложными шагами для оптимизации. Желательно попробовать несколько временных точек и концентраций используемых реагентов. Еще одной проблемой является обращение с сетками, для которых работает только терпение и, конечно же, практика.

Демонстрировать процедуру будут Чоудхури Абдулла, почтовый сотрудник, Назнин Ремекс, аспирант из моей лаборатории, и Брэндон Хартман, руководитель электронной микроскопии из наших служб электронной микроскопии. После обезболивания мышей и вскрытия грудной полости обижают сердце с помощью ледяного холода 3%-глутаральдегида в 0,1 моляра буфера какодилата натрия в течение двух минут. Используйте иглу 25 калибра пять на восемь дюймов, чтобы ввести фиксаторы в сердце, используя гравитационное давление.

Сразу после того, как сердце начнет наполняться фиксирующим средством, поднимите верхушку сердца, чтобы снять давление. Разрежьте сосуды под ними на расстоянии одного-двух миллиметров от сердца и дайте жидкостям стекать. Рассекните сердце.

Удалите предсердия и опустите желудочки в чашку Петри, содержащую ледяной холодный 3% глутаральдегида и 0,1 молярного какодилата натрия. Сделайте разрез бабочки после 30-60 минут фиксации и поместите желудочек обратно в чашку Петри. Нарежьте сердце хирургическим лезвием небольшими кубиками по одному кубическому миллиметру.

Зафиксируйте и погрузите рассеченную сердечную ткань в раствор глутаральдегида и какодилата на 24 часа при четырех градусах Цельсия. После 24 часов фиксации промыть ткань в 0,1 молярном буфере какодилата натрия дважды в течение 20 минут. Удалить ткань из буфера какодилата натрия и погрузить в 2%-ный раствор тетроксида осмия на четыре часа при комнатной температуре.

После осмикации погрузить ткань в 2%-ный раствор ацетата натрия на 10 минут при комнатной температуре. Далее погружают ткань в 2%-ной раствор уранилацетата на один час при комнатной температуре. После окрашивания уранилацетата обезвоживают ткани последовательно через градуированные спирты и ацетон.

Встроить обезвоженную ткань в эпоксидную смолу с низкой вязкостью, как описано в рукописи. Поместите ткань в свежую смолу в восьмимиллиметровых микроформах и вылечите внедренную ткань при 70 градусах Цельсия в течение ночи. Найдя интересующую область, используя нож ultra 45 градусов, изготовьте ультратонкие срезы из бледного золота.

Поместите эти ультратонкие секции на тусклую сторону медной сетки из 200 ячеек. Начните окрашивание с распаковки антигена, положив 20 микролитров травильного раствора метапериодата на чистую парафиновую пленку. Поместите высушенную сетку с участками ткани на каплю травильного раствора.

Оставьте сетку секций на растворе на 30 минут при комнатной температуре. Промыть вытравленные участки ткани, поместив их на каплю дистиллированной воды на 60 секунд. Блокируют остаточные альдегиды, помещая сетку секций на каплю 0,05 молярного раствора глицина в течение 10 минут при комнатной температуре.

Промокните края сетки на фильтровальной бумаге, чтобы удалить остаточный раствор глицина. Поместите сетку секций в 10-20 микролитров блокирующего раствора на 25 минут при комнатной температуре. Промокните края сетки на фильтровальной бумаге и поместите участки сетки на разбавитель антител для кондиционирования при комнатной температуре в течение 10 минут.

Инкубируют срезы сетки с первичным антителом в течение одного часа 30 минут в увлажненной камере. Промокните сетку и промыть участки сетки разбавителем антител дважды в течение пяти минут каждый. Инкубируют срезы сетки с биотинилированным вторичным антителом в течение одного часа в увлажненной камере.

После того, как сетка высохнет, промыть участки сетки разбавителем антител дважды в течение пяти минут каждый. Инкубируют секции сетки в коммерчески доступном стрептавидине, сопряженном QD, в течение одного часа в камере при комнатной температуре. Предотвратите воздействие света, покрыв камеру алюминиевой фольгой.

После смазывания краев сетки фильтровальной бумагой промыть участки сетки, поместив их на капли воды на две минуты и промокнуть края сетки до высыхания. Вставьте держатель образца в колонку микроскопа и задействуйте переключатель насоса для оценки гониометра, а затем полностью вставьте держатель образца в колонку микроскопа. Сосредоточьтесь хорошо на нужной области.

Захватите изображение с помощью высокоскоростной цифровой камеры и сохраните файл в формате tif. Митохондриальные мембраны, лизосомы и эндоплазматический ретикулум или митохондриальный интерфейс мембраны саркоплазматического ретикулума показали наличие меченых Sigmar1 квантовых точек. Участки сердца были визуализированы с использованием иммуноглобулина G кролика и квантовых точек в качестве изотипа контроля для первичного антитела кролика против Sigmar1.

Одна важная вещь, которую следует учитывать при работе над этим протоколом, - это время демаскации для антигена. Если участки ткани травятся слишком долго, раствор метапериодата создаст перфорации в тонких тканевых срезах. Квантово-точечная маркировка привлекает внимание при обнаружении опухолей, профилировании молекулярного и иммунного статуса опухоли и визуализации тканей, прокладывая новый способ медицинской диагностики.

Квантовые точки также полезны при лечении опухолей с помощью фотодинамической терапии и офтальмологических аномалий, доставляя лекарства к глазам.