Восстановление сборки септина на мембранах для изучения биофизических свойств и функций

Этот протокол поможет тем, кто работает над мембраносвязывающими белками, определить, как форма мембраны играет роль в организации белковых сборок. Основным преимуществом этого метода является его универсальность для типа белка, состава мембраны и геометрии мембраны. Это также позволяет исследовать, как липидный бислой может изменять свойства ассоциированных белков.

Чтобы определить хорошую мембрану для эксперимента, мы предлагаем установить контрольный список, который может включать скорость диффузии липидов, подвижность интересующего белка и наличие невзрывных липосом или слитых липосом, прилипших к поверхности. Чтобы начать плазменную очистку слайдов, продуйте плазмоочиститель в течение пяти минут кислородом, чтобы удалить воздух из линий и камеры. Уложите стеклянные горки с сухим покрытием в керамическую колыбель.

Во время продувки направьте инертный газ на стекла микрозакрытия, чтобы удалить пыль и твердые частицы. Поместите люльку в заднюю часть плазменной камеры так, чтобы крышки были параллельны длинному краю камеры. Запустите плазмоочиститель в течение 15 минут с кислородом на максимальной мощности.

Для приготовления камеры отрежьте колпачок чуть ниже матовой части 0,2-миллилитра ПЦР-трубки. Покрасьте ободок трубки ПЦР УФ-активированным клеем, избегая внутренней части трубки. Аккуратно поместите клей трубки ПЦР вниз в центр очищенного плазмой покровного листа, затем поместите камеру под длинноволновый ультрафиолетовый свет в течение пяти-семи минут, чтобы вылечить клей.

Чтобы сформировать бислой, добавьте реагенты в лунку. Осторожно встряхните камеры из стороны в сторону, чтобы нарушить работу внедорожников, а затем высиживайте при 37 градусах Цельсия в течение 20 минут. После инкубации промойте бислой шесть раз 150 микролитрами SLBB путем пипетки, чтобы смыть лишние липиды, затем промыть бислой шесть раз 150 микролитрами реакционного буфера перед инкубацией с септинами.

На последнем этапе промывки удалите реакционный буфер, оставив в лунке 75 микролитров. Добавьте 25 микролитров септинов, разбавленных в SSB, и изображение с помощью микроскопии TIRF. Сначала вращайте бутылку, содержащую микросферы кремнезема, в течение 15 секунд, затем втирайте ультразвук в течение одной минуты и снова вихрь в течение 15 секунд, чтобы разбить любые кластеры.

Смешайте шарики с SLBB и 10 микролитрами пяти миллимолярных внедорожников в микроцентрифужной трубке с низкой адгезией. Инкубируйте шариковую липидную смесь в течение одного часа при комнатной температуре на шейкере, чтобы предотвратить осаждение. Тем временем разморозьте пегилированную крышку и приклейте к ней разрезанную 0,2-миллилитровую ПЦР-трубку.

После инкубации центрифугируют шарики в течение 30 секунд на назначенном RCF. После первого отжима удалите 50 микролитров супернатанта, затем добавьте 200 микролитров PRB и перемешайте путем энергичной пипетки. Для следующих раундов удалите 200 микролитров PRB и добавьте еще 200 микролитров после второго и третьего вращения и добавьте 220 микролитров PRB после четвертого вращения.

Если проводится конкурсный анализ с несколькими размерами шариков, подготовьте реакцию, смешивая равные объемы каждого размера бусины и разбавляя 29 микролитров этой бисерной смеси 721 микролитром реакционного буфера, затем добавьте в лунки 75 микролитров разбавленных шариков и 25 микролитров белка, разбавленного в SSB, и перемешайте. При измерении септинов в установившемся состоянии инкубируют смесь при комнатной температуре в течение одного часа, а затем снимают с помощью TIRF или конфокальной микроскопии. Микроснимки TIRF планарных SLP, инкубированных с септинами, показанные зеленым цветом, показали однородное распределение белка.

SLB, изготовленные с плохо очищенными стеклянными крышками, показали отверстия или зазоры в бислое в областях с низким септином. Невспытающие и трубчатые липосомы могут накапливаться на поверхности, если используются старые липосомы или если промывки не являются строгими. На микроснимках микросфер с липидным покрытием, визуализированных с помощью родамина, ПЭ показал гладкое двухслойное осаждение.

Сферические опоры были равномерно покрыты мембраной, и было мало скоплений бусин. Недостаточное промывание избытка липидов приводило к неравномерному покрытию мембраны, наблюдаемому при липидных сгустках, а неправильное обращение вызывало зазоры в бислое. Недостаточное перемешивание шариков вызвало слипание, которое не идеально подходит для измерения общего поглощения белка.

Используя поддерживаемые липидные бислои, представленные здесь, другие методы, такие как флуоресцентная пожизненная визуализационная микроскопия, массовая цитометрия мембран и высокоскоростная атомно-силовая микроскопия, могут быть выполнены для изучения различных белково-белковой или белково-мембранной динамики.