Одноклеточная визуализация всего мозга и анализ интактного мозга новорожденных мышей с использованием МРТ, очистки тканей и микроскопии световых листов
1 августа 2022 г.
Этот протокол описывает методы проведения магнитно-резонансной томографии, очистки и иммуномаркировки интактного мозга мыши с использованием iDISCO+, за которым следует подробное описание визуализации с использованием микроскопии светового листа и последующих анализов с использованием NuMorph.
С около 100 миллионами клеток в мозге мыши и размерами изображений клеточного разрешения всего мозга, приближающихся к терабайтной шкале, для точной количественной оценки клеток необходимы передовые инструменты анализа изображений. Наш вычислительный конвейер может предварительно обрабатывать изображения и количественно оценивать ядра в коре головного мозга мыши, сохраняя при этом разумный компромисс между точностью обнаружения клеток, временем визуализации и вычислительными ресурсами. Демонстрировать процедуру будут Феликс Кайер и Ян Кертин, аспиранты из моей лаборатории.
Для начала установите образец в держатель правильного размера образца таким образом, чтобы образец был ориентирован с z-размерностью не более 5,2 миллиметра в глубину из-за номинального рабочего расстояния микроскопа UltraMicroscope II. Затем вставьте держатель в колыбель образца таким образом, чтобы винт держателя находился под углом 45 градусов к опорам люльки. Затем поместите люльку в такое положение, чтобы образец был ориентирован перпендикулярно световому пути.
После этого установите масштаб на микроскопе на 4-кратное увеличение или выше, что дает 0,75 микрометра на пиксель. В программном обеспечении Inspector Pro выберите один световой лист с числовым значением диафрагмы приблизительно 0,08. Чтобы обеспечить поддержание осевого разрешения по ширине изображения, выберите «Горизонтальная динамическая фокусировка» и примените рекомендуемое количество шагов в зависимости от длины волны лазера.
Затем отрегулируйте тонкую фокусировку для каждого канала по отношению к каналу регистрации и мощность лазера на канал по отношению к свойствам канала. Затем отрегулируйте ширину светового листа примерно до 50%, чтобы обеспечить оптимальное распределение мощности листа в измерении Y для размера образца. После этого установите количество плиток по отношению к размеру образца с рекомендуемым перекрытием 15% между плитками и захватите изображения для каждого канала последовательно для каждого стека в заданном положении плитки.
Сначала загрузите и установите диспетчер среды Conda для Linux и инструментов обработки изображений NuMorph. В командной строке запустите matlab и NM_setup. m от NuMorph для загрузки и установки пакетов программного обеспечения для анализа изображений, необходимых для анализа.
Затем укажите имена образцов, входные и выходные каталоги, информацию о каналах и параметры изображения светового листа, отредактировав файл NM_samples.m. Для регулировки интенсивности в NMp_template установите интенсивную настройку на true, а use_processed_images как false при работе с новым набором изображений. Затем установите save_images и save_samples как истинное.
Затем установите базовое затенение плитки, чтобы применить коррекцию затенения с помощью базового алгоритма, или вручную, чтобы применить коррекцию затенения плитки с помощью измерений из UltraMicroscope II при определенной ширине светового листа. Для выравнивания канала изображения в NMp_template задайте для channel_alignment значение true, а для alignment_method канала — трансляцию или эластичность. Затем установите значение sift_refinement true и значение перекрытия 0,15, чтобы соответствовать перекрытиям плиток во время создания изображения.
Чтобы выполнить шаги предварительной обработки в MATLAB, укажите имя образца и задайте для конфигурации NM_config пример процесса. Затем выполните любой из шагов предварительной обработки, указав NM_process стежка конфигурации, указав этап с использованием интенсивности, выравнивания или сшивания, и проверьте выходной каталог на наличие выходных файлов для каждого из этапов. Начните с 3D-изображения Атласа и связанного с ним изображения аннотации, которое присваивает каждый воксель определенной структуре.
Выровняйте изображение Атласа и файл аннотации, чтобы убедиться, что они правильно совпадают в правильной ориентации. После выравнивания обработайте файлы в NuMorph, чтобы указать входные данные, как описано в рукописи, выполнив команду. В NMa_template установите для resample_images значение true и resample_resolution в соответствии с Atlas.
Затем укажите номер канала для ресамплинга с помощью resample_channels. После этого установите для register_images значение true, укажите atlas_file, соответствующий файлу в каталоге Atlas, и установите registration_parameters по умолчанию. Затем установите для save_registered_images значение true.
Для обнаружения ядер, подсчета клеток и классификации установите как count_nuclei, так и classify_cells как истинные. Затем установите для count_method значение 3dunet и min_intensity, чтобы определить минимальный порог интенсивности для обнаруженных объектов. Затем установите classify_method либо порога, который основан на неконтролируемой интенсивности флуоресценции в центроидных положениях, либо SVM, который моделирует контролируемый линейный классификатор опорных векторов машины.
Чтобы выполнить шаги анализа в MATLAB, укажите имя образца и задайте конфигурацию NM_config анализа образца. Затем выполните любой из шагов анализа, указав NM_analyze этап конфигурации, указав этап с помощью ресамплинга, регистрации, подсчета или классификации, и проверьте выходной каталог на наличие выходных файлов для каждого из этапов. В NMe_template установите для параметра update значение true и compare_structures_by для любого индекса.
Затем задайте файл шаблона и таблицу структур, которая определяет все возможные структурные индексы и структуры для оценки при указании подсчета ячеек и классификации типов ячеек. Очистка тканей с использованием протокола iDISCO+ и нейронально-слой-специфических маркеров ядер привела к четко определенным клеточным группам нейронов верхнего и нижнего слоя в изокортексе. Подсчет клеток с помощью NuMorph зависел от успешных этапов предварительной обработки, включая регулировку интенсивности, выравнивание каналов и сшивание.
Однако ошибки на этапах предварительной обработки могут привести к неправильному сшиванию, что приведет к неправильному выравниванию и сшиванию и, таким образом, приведет к изображениям с рисунком в фокусе и вне фокуса. Чтобы подсчитать ядра из определенных областей мозга, сшитые изображения будут аннотированы с помощью Atlas, что позволит накладывать аннотации на области мозга. Центроиды ядер были обнаружены с помощью обученной 3D-модели U-Net в NuMorph с около 12 миллионами общих ядер, которые были TO-PRO-3-положительными в изокортексе с примерно 2,6 миллионами мозг-двухположительных и 1,6 миллионами CTIP2-положительных ядер.
Было обнаружено около 3,7 и 2,9 млн TO-PRO-3-положительных суммарных ядер в базальных ганглиях и аллокорте гиппокампа соответственно. Тем не менее, два положительных клетки мозга, обнаруженные в этих двух областях мозга, были незначительными, и только около 1,5 из менее чем одного миллиона CTIP2-положительных клеток были обнаружены в базальных ганглиях и аллокорте гиппокампа. Выполняйте визуальные проверки качества во время приобретения, чтобы добиться хорошей сегментации.
И правильно настроить среду Conda, чтобы гарантировать, что при последующем анализе не возникает ошибок. В дополнение к подсчету клеток, этот конвейер позволяет интегрироваться с другими инструментами сегментации, которые измеряют размер и форму клеток, которые затем можно сравнивать по группам генотипов. С помощью нашего конвейера мы можем определить, как анатомия мозга изменяется при клеточном разрешении, что приводит к идентификации типов клеток и областей мозга, важных для риска заболевания.
Просмотрите полный транскрипт и получите доступ к тысячам научных видео
Обзор
В данном исследовании представлен протокол визуализации интактного мозга мыши с помощью магнитно-резонансной томографии, просветления и иммуномаркировки с использованием метода iDISCO+ и светолистowej микроскопии. Метод направлен на обеспечение точного количественного анализа клеток в коре головного мозга мыши с применением передовых инструментов анализа изображений.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Нейробиология
- Методы визуализации
- Клеточный количественный анализ
Теоретические основы
- Мозг мыши содержит примерно 100 миллионов клеток.
- Изображения высокого разрешения могут достигать терабайтных размеров, что требует использования передовых инструментов анализа.
- Протокол iDISCO+ имеет решающее значение для просветления и иммуномаркировки образцов мозга.
- Лист-микроскопия позволяет детально визуализировать сложные структуры.
Цель исследования
- Совершенствование методов проведения 3D-визуализации мозга мыши.
- Представление вычислительного конвейера для предобработки и количественного анализа клеточных данных.
- Демонстрация возможности выявления отдельных популяций нейронов в различных областях мозга.
Используемые методы
- Для получения изображений использовалась светолистная микроскопия с применением UltraMicroscope II.
- В качестве биологической модели использовались интактные головные мозги мышей, предназначенные специально для количественного анализа клеток.
- Для предварительной обработки и анализа данных визуализации использовался вычислительный конвейер NuMorph.
- Основные этапы процедуры включали монтаж образцов, настройку параметров визуализации и использование MATLAB для обработки данных.
Основные результаты
- Ядра были обнаружены с высокой точностью с помощью обученной модели 3D U-Net, что позволило провести обширный клеточный анализ.
- В изокортексе и других областях мозга было количественно определено около 12 миллионов ядер в общей сложности.
- Ошибки при предварительной обработке были отмечены как критические для обеспечения точного совмещения изображений и подсчета клеток.
- Успешная обработка привела к четкой визуализации специфических популяций нейронов, что способствовало пониманию структуры коры.
Выводы
- Данный протокол совершенствует методы визуализации, позволяя проводить детальные исследования архитектуры мозга.
- Комплексное использование iDISCO+ и плоскостной световой микроскопии демонстрирует важность предварительной обработки для получения точных результатов анализа.
- Полученные данные имеют важное значение для дальнейших исследований нейронных механизмов и моделей заболеваний.
Часто задаваемые вопросы
Практическая значимость для промышленности
Одноклеточная визуализация всего мозга с помощью МРТ, просветления тканей и плоскостной световой микроскопии позволяет проводить количественный регионоспецифический клеточный анализ с беспрецедентным масштабом и разрешением. Этот интегрированный рабочий процесс обеспечивает высокую точность структурного и клеточного картирования, что имеет критическое значение для валидации мишеней и снижения механистических рисков при разработке нейробиологических лекарственных препаратов. Данный подход повышает прогностическую ценность ранних этапов поиска и трансляционных исследований, обеспечивая комплексную и непредвзятую количественную оценку клеточных фенотипов в интактных областях мозга.
Стратегические области применения в биофармацевтических исследованиях и разработках
Ранний поиск и валидация мишени
- Обеспечивает количественный анализ влияния генетических или средовых факторов на структуру мозга с разрешением до одной клетки.
- Поддерживает функциональную валидацию мишеней путем картирования распределения типов клеток и региональных изменений.
- Способствует снижению механистических рисков за счет непредвзятого количественного анализа клеток всего мозга.
- Повышает прогностическую достоверность при отборе проектов из портфеля, выявляя тонкие фенотипические различия, которые упускаются при анализе срезов тканей.
Скрининг и разработка анализа
- Подготовка валидированных аннотированных 3D-моделей мозга для последующих рабочих процессов фенотипического скрининга.
- Стандартизация протоколов визуализации и количественного анализа для воспроизводимого высокопроизводительного клеточного анализа.
- Обеспечение масштабируемых количественных результатов, подходящих для сравнительных исследований различных генотипов или групп лечения.
- Поддержка достоверной оценки влияния соединений на популяции клеток и архитектуру мозга.
Трансляционные и доклинические исследования
- Сопоставляет клеточное фенотипирование с соответствующими областями мозга и биомаркерами заболевания.
- Обеспечивает непрерывность процесса от этапа поиска до доклинической валидации за счет возможности сравнительного анализа клеточной архитектуры в разных исследованиях.
- Поддерживает принятие решений о продвижении проекта с учетом рисков путем количественной оценки структурных и клеточных конечных точек, значимых для моделей заболеваний.
- Повышает эффективность прогностического снижения рисков для портфелей в области трансляционной нейронауки.
Интеграция конвейеров и рабочих процессов
Данный рабочий процесс связывает этапы первичного поиска, идентификации перспективных соединений и доклинических исследований, предоставляя масштабируемую платформу для одноклеточного анализа всего мозга.
- Биологические исследования: Обеспечивают проверку гипотез и уточнение сигнальных путей путем количественной оценки региональных клеточных изменений.
- Скрининг: Позволяет получать воспроизводимые количественные результаты визуализации для разработки анализов и скрининга соединений.
- Аналитика: Обеспечивает получение высококонтентных измерений и статистических данных для достоверного сравнения экспериментальных условий.
- Трансляционные исследования: Позволяют сопоставлять клеточные фенотипы с моделями заболеваний и стратегиями поиска биомаркеров.
- Корпоративное использование: Предлагает повторно используемый вычислительный конвейер с открытым исходным кодом, адаптируемый для различных нейробиологических исследований.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: Повышает прогностическую достоверность и снижает механистическую неопределенность при валидации нейробиологических мишеней.
- Операционная ценность: Стандартизирует и масштабирует визуализацию и анализ всего мозга для проведения воспроизводимых высокопроизводительных исследований.
- Стратегическая ценность: Оптимизирует принятие решений о продолжении или прекращении разработки (go/no-go) и повышает эффективность использования капитала за счет обеспечения комплексного и непредвзятого количественного анализа клеток.
- Влияние на портфель: Обеспечивает приоритизацию и продвижение активов в области нейробиологии с учетом скорректированных рисков.
Особенности реализации
- Требуется опыт работы с методами современной микроскопии, просветления тканей и компьютерного анализа изображений.
- Необходим доступ к платформам плоскостной микроскопии (light-sheet microscopy) и высокопроизводительной вычислительной инфраструктуре.
- Требуется строгая стандартизация протоколов визуализации и анализа между различными исследовательскими группами.
- Метод может быть адаптирован для различных моделей мышей и областей мозга при использовании соответствующих стратегий иммуномаркировки.
- Точность количественного анализа и аннотирования зависит от качественной предварительной обработки и контроля качества.
