Стандартизированный преаналитический протокол жидкой биопсии для последующих применений ДНК без циркуляции

Это стандартный протокол для обработки и хранения образцов крови для последующей жидкой биопсии на основе циркулирующей свободной ДНК. Это первый опубликованный стандартный протокол, хотя техника используется уже несколько лет. За ним легко следить со стандартным оборудованием, доступным в большинстве трансляционных или научных лабораторий.

Протокол может быть выполнен всем персоналом лаборатории. Протокол помогает стандартизировать то, как мы собираем и храним образцы, что в конечном итоге повлияет на клинику и уменьшит изменчивость между различными центрами, выполняющими один и тот же или аналогичный последующий анализ, где точность имеет первостепенное значение. Этот метод особенно полезен в онкологических исследованиях, а также в клинических применениях.

Тем не менее, он также может применяться при других нераковых заболеваниях, где также используется жидкая биопсия. После того, как образец крови был центрифугирован, знание того, сколько плазмы или сыворотки удалить, может быть затруднено, но следование этим конкретным рекомендациям поможет в этом. Остальная часть протокола очень проста в соблюдении с ограниченным опытом работы в лаборатории.

Демонстрировать процедуру будет Хорхе, техник из нашей лаборатории. Для начала центрифугируют пробирку, содержащую свежую кровь комнатной температуры, в течение 10 минут в 1600 раз г, с максимальным перерывом. Осторожно извлеките трубку из центрифуги.

Верхняя фаза сывороточного супернатанта будет казаться прозрачной и желтоватой. Проверьте, показывает ли образец признаки гемолиза и запишите наличие гемолиза, когда это необходимо. В шкафу биобезопасности класса II перенесите сыворотку в сборные пробирки в виде 250-микролитровой аликвоты.

Аликвоты должны быть правильно обозначены. Немедленно заморозьте сыворотку в вертикальном положении в ящике для хранения при минус 80 градусах Цельсия и запишите время хранения образца. Убедитесь, что образцы были обработаны в течение требуемых четырех часов.

Центрифугировать эдта-трубку при комнатной температуре в течение 10 минут при 1600 г, с максимальным перерывом. После центрифугирования супернатант плазмы будет казаться прозрачным и желтоватым. Проверьте, есть ли в образце признаки гемолиза, и перенесите плазму в 15-миллилитровую центрифужную трубку, не нарушая клеточный слой, используя одноразовую серологическую пипетку.

Оставьте небольшой остаточный объем плазмы над клеточным слоем примерно в пять миллиметров. Если наблюдается гемолиз, выбросьте образец для дальнейшего анализа. Центрифугирование плазмы и 15-миллилитровой центрифужной трубки для удаления любых остаточных неповрежденных клеток крови, перенесенных с первой стадии центрифугирования.

Осторожно извлеките трубку из центрифуги, а не гранулу ячейки в нижней части трубки, и переведите от одного до четырех миллилитров плазмы в один-четыре миллилитра полипропиленовой криогенной биос или Eppendorfs с помощью одноразовой серологической пипетки. Остаточный объем плазмы должен быть оставлен в нижней части трубки, чтобы избежать загрязнения плазмы клетками крови. Немедленно заморозьте плазму в вертикальном положении в ящике для хранения при температуре минус 80 градусов Цельсия и запишите время хранения образца.

Убедитесь, что образцы правильно маркированы и обработаны в течение требуемых четырех часов. Соберите клеточный слой с помощью P1000 и отфильтрованного наконечника и переложите его в двухмиллилитровую трубку. Немедленно заморозить и хранить при минус 80 градусах Цельсия.

Здесь показан пример высококачественной экстракции cfDNA, которая может быть использована для последующих применений, тогда как это графическое изображение представляет собой пример неподходящего образца с высоким уровнем геномного загрязнения. Плазменная или сывороточная фракция должна быть желтого цвета. Это может варьироваться в зависимости от конкретного образца.

Образцы с гемолизом следует выбросить. Будьте осторожны, чтобы не удалить гранулы клеток при удалении плазменной фракции. Этот протокол также может быть использован для других применений на основе нуклеиновых кислот и белков, таких как обнаружение некодирующих РНК или белков в образцах сыворотки и плазмы с использованием методов иммунообнаружения.

Это очень стандартная методика, используемая во многих лабораториях. Этот протокол помогает исследователям стандартизировать то, как мы выполняем наш анализ, поскольку это важный аспект, необходимый для будущих клинических применений.