Отбор аптамеров in vitro для дифференциации инфекционных вирусов от неинфекционных

Этот протокол описывает, как выбрать ДНК-аптамеры, которые могут различать инфекционные вирусы и неинфекционные вирусы, чтобы получить чувствительную молекулу, способную информировать об инфекционности клинических образцов или образцов окружающей среды. Этот метод может быть применен для получения селективных аптамеров для многих других вирусов, включая новые вирусы, поскольку он не требует предварительного знания структур или последовательностей вируса. Этот метод позволяет разрабатывать аптамерные датчики для клинической диагностики и мониторинга окружающей среды инфекционных вирусов, чтобы определить, заразен ли кто-то или метод дезинфекции окружающей среды работает должным образом.

Отбор может быть сложным процессом, особенно для тех, кто в нем новичок. Важно оптимизировать условия ПЦР и следить за ходом отбора с помощью кПЦР. Продемонстрировать процедуру будет Маркос Грамахо, аспирант из моей лаборатории.

Для начала разработайте исходную одноцепочечную библиотеку или библиотеку SS-ДНК и праймеры. Получение олиго ДНК из коммерческих источников с помощью стандартной обессоливающей очистки. Очистите библиотеку SS-ДНК и праймеры на 10%-ном денатурирующем электрофорезе в полиакриламидном геле с последующим осаждением этанола.

Далее получают исходный раствор инфекционных и неинфекционных вирусов или готовят их так, как описано в текстовой рукописи. Для денатурации библиотеки SS-ДНК смешайте 10 микролитров 100-микромолярной библиотеки SS-ДНК с 240 микролитрами буфера SELEX. Нагрейте смесь при температуре 95 градусов Цельсия в течение 15 минут в сухой ванне, затем поместите трубку на лед на 15 минут.

Смешайте 250 микролитров библиотеки SS-ДНК в буфере SELEX с 50 микролитрами инфекционного вируса для положительного отбора. Инкубировать в течение двух часов при комнатной температуре. Затем добавьте 400 микролитров одной миллимолярной последовательности T20 в фильтр объемом 0,5 миллилитра, чтобы заблокировать неспецифические участки.

Выдерживайте фильтры в течение 30 минут. Центрифугируйте фильтр при 14 000 G в течение 10 минут, чтобы удалить раствор Т20. Затем трижды промойте фильтр буфером SELEX, чтобы удалить излишки последовательностей T20.

Затем добавьте смесь инфекционных вирусов библиотеки SS-DNA в заблокированный фильтр мощностью 100 килодальтон и центрифугу для промывки несвязанных последовательностей. Трижды промойте фильтр, добавив 400 микролитров буфера SELEX и центрифугирование. Держите фракцию в фильтре и отбрасывайте проточную.

Для элюирования связанных последовательностей замените сборную пробирку центрифужного фильтра и добавьте в фильтр 300 микролитров буфера SELEX, содержащего восемь моляров мочевины. Нагрейте фильтр до 95 градусов Цельсия в течение 15 минут, затем центрифугу для сбора проточного потока, содержащего элюированные последовательности. После этого промойте материалы 10% отбеливателем.

Затем добавьте раствор инфекционного вируса SS-ДНК, собранный на предыдущем этапе, в заблокированный фильтр мощностью 10 килодальтон, центрифугу при 14 000 г в течение 15 минут и откажитесь от проточного потока. Трижды промойте фильтр 300 микролитрами буфера SELEX, чтобы удалить мочевину центрифугированием, и выбросьте проточный. Восстановите раствор в фильтре, перевернув его вверх дном в чистой сборной трубке и центрифугируя в течение пяти минут.

Измерьте конечный объем восстановленного раствора с помощью пипетки и пометьте его как образец раунда 1А. Возьмите 90% образца раунда 1А в качестве шаблона в первом раунде и запустите ПЦР в оптимизированных условиях. Чтобы восстановить SS-ДНК с использованием магнитных шариков, модифицированных стрептавидином, или МБ, разделите продукт на аликвоты по 50 микролитров и добавьте их в микроцентрифужные пробирки, содержащие 50 микролитров МБ. Инкубируйте пробирку в течение 30 минут при легком перемешивании при комнатной температуре.

Затем поместите трубку на магнитную стойку, чтобы изолировать MB и удалить надосадочную жидкость пипеткой. Промойте MB дважды, добавив в тюбик 200 микролитров связующего и промывочного буфера. Затем снимите трубку с магнитной стойки и постучите по ней, прежде чем снова суспендировать MB до однородного раствора путем пипетки.

Снова поместите трубку на магнитную стойку и удалите надосадочную жидкость. После второй стирки ресуспендируйте MB в 100 микролитрах буфера SELEX и нагревайте раствор при температуре 95 градусов Цельсия в течение 10 минут. Немедленно поместите пробирку в магнитную стойку и соберите надосадочную жидкость, содержащую пул SS-ДНК.

Повторите этот шаг восстановления, добавив 50 микролитров буфера SELEX. Измерьте окончательный объем извлеченной фракции и обозначьте его как Round 1X. Для денатурации пула SS-ДНК возьмите 60% образца Round 1X и смешайте его с 50 микролитрами буфера SELEX.

Нагрейте образец в сухой ванне, затем поместите пробирку на лед на 15 минут. Затем смешайте денатурированный пул SS-ДНК в буфере SELEX с 50 микролитрами каждого вируса в качестве этапа контротбора и инкубируйте в течение одного часа при комнатной температуре. После блокировки неспецифических участков в центрифужных фильтрах добавьте смесь денатурированного пула SS-ДНК, инкубированного с вирусным раствором, в заблокированный фильтр мощностью 100 килодальтон.

Центрифугируйте фильтр при 14 000 G в течение 10 минут и собирайте проточку. Возьмите 300 микролитров фракции и смешайте с 50 микролитрами инфекционного вируса, содержащего 100 миллионов копий на миллилитр. Инкубировать в течение двух часов при комнатной температуре.

Приготовьте стандартную мастер-смесь для кПЦР и разведения очищенной библиотеки SS-ДНК, как описано в тексте. Запустите qPCR, чтобы определить пороговый цикл. После прогона используйте стандартную кривую для количественной оценки количества SS-ДНК в раунде 1A и раунде 1X.

Затем рассчитайте выход элюирования как связанное количество ДНК, деленное на исходное количество ДНК, и постройте график зависимости выхода элюирования от круглого числа. Наконец, постройте кривые плавления для разных раундов. Для виртуализации с высокой пропускной способностью выберите подходящий коммерчески доступный комплект.

Подготовьте несколько пулов раундов выборки, представляющих высокое, среднее и низкое обогащение, а также окончательный пул, используя разные пары индексов в адаптерах для каждого пула. Затем отправьте подготовленную окончательную библиотеку в центр секвенирования. Для анализа секвенирования последовательности были демультиплексированы средством секвенирования.

Удалите адаптеры виртуализации и праймеры выделения с помощью программы командной строки Cutadapt. Затем используйте программу FASTX-Toolkit для удаления некачественных последовательностей. Затем объедините файлы последовательностей в обратном направлении с файлами в прямом направлении с помощью функции дополнения FASTX-Toolkit FASTX_reverse_ в файлах обратного направления.

Затем используйте встроенную программу CAT, чтобы объединить файлы в один файл. Используйте набор инструментов анализа FASTAptamer для анализа обогащения последовательностей в различных пулах выборки. Во-первых, чтобы использовать функции FASTAptamer count и FASTAptamer cluster для группировки похожих последовательностей в кластеры.

Затем используйте функцию обогащения FASTAptamer для получения информации об обогащении последовательностей и кластеров. Определите последовательности аптамеров-кандидатов на основе информации об обогащении, полученной в результате анализа последовательностей. Выберите несколько последовательностей аптамеров и выполните первоначальный скрининг с помощью анализа связывания.

В этом анализе кПЦР использовалась для мониторинга прогресса SELEX инфекционных аптамеров SARS-CoV-2. Выход элюирования первоначально увеличивался с каждым раундом SELEX и выравнивался в восьмом и девятом раундах. Сравнивая кривые плавления, наблюдался сдвиг от пика при высокой температуре плавления от 77 до 79 градусов по Цельсию.

Более того, в последних двух раундах наблюдался пик при низкой температуре плавления. Показано относительное количество чтений на миллион для секвенированного SARS2 AR10, полученного в последовательных раундах отбора. Предсказанная структура SARS2 AR10 показала структурированную вторичную структуру, содержащую область стволовой петли, которая может быть вовлечена в распознавание вируса.

После того, как аптамеры получены, они могут быть включены в электрические оптики, другой тип датчиков, для разработки портального и быстрого теста на обнаружение вирусов, который может информировать о вирусной заразности. Мы предполагаем, что может быть получен аптамер, специфичный для различных вариантов или стереотипов вируса, что позволит быстро отслеживать варианты, которые представляют наибольшую угрозу для общества.