Техника инъекции эмбриона для редактирования генов у черноногого клеща, Ixodes scapularis

Это первый протокол инъекции эмбриона для вида Chelicerata. Возможность инъекции эмбрионов клещей откроет многие направления исследований, в частности, исследования функции генов клещей и взаимодействий патогенов клещей. Этот метод позволяет в будущем работать над функциональными исследованиями генов клещей и обеспечивает основу для контроля популяции клещей с использованием систем генного драйва.

Этот метод облегчит понимание взаимодействия между клещами и патогенами, которые они содержат на молекулярном уровне. Это позволит выявить белки, которые могут быть использованы для разработки вакцин против болезни Лайма и других возбудителей. В то время как несколько областей исследований, таких как взаимодействие патогенов клещей и передача патогенов хозяевам клещом во время кормления, выиграют от этой работы.

Более фундаментальные вопросы, такие как то, как клещи уклоняются от иммунного ответа хозяина, и различия в механизмах репарации ДНК также могут быть поняты сейчас. Есть несколько аспектов биологии клещей, которые необходимо понять перед проведением этой процедуры. Высокое внутреннее давление эмбриона приводит к разрыву при прикосновении иглы.

Очень важно подготовить эмбрионы к инъекции. Для начала переведите самок с четырех градусов Цельсия в инкубатор 27 градусов Цельсия для начала яйцекладки за неделю до инъекций. Через три-четыре дня, когда самки начнут откладывать яйца, удалите все яйца, используя кисть с мелким наконечником, подготавливая самок к абляции органов Гена.

Чтобы опорожнить железу, расположите клеща на стеклянной горке под микроскопом таким образом, чтобы части рта были видны как на вентральной, так и на спинной сторонах. Затем осторожно проколите область за частями рта на спинной стороне, и надавите на вентральную сторону с помощью щипцов. Поместите край безворсовой салфетки и удалите жидкий воск, выходящий из места прокола.

В качестве альтернативы, вместо опорожнения железы путем рассечения, клеи, такие как тканевый клей, могут быть использованы вокруг частей рта клеща. Когда самки снова начнут откладывать яйца, используйте тонкую кисть, чтобы собрать свежеотложенные яйца и поместите их в микроцентрифужную трубку размером 1,5 миллилитра. Добавьте приблизительно 200 микролитров 5% хлоридной воды бензалкония в пробирку, содержащую яйца возрастом от нуля до 18 часов.

Осторожно закрутите яйца кистью в течение пяти минут, чтобы яйца не осели в нижней части трубки, и удалите супернатант с помощью микропипетки, оставив яйца в трубке. Добавьте приблизительно 200 микролитров дистиллированной воды в трубку, содержащую яйца. Закрутите кистью и извлеките воду из микроцентрифужной трубки с помощью микропипетки.

После промывки дистиллированной водой добавьте примерно 200 микролитров 5% хлорида натрия и аккуратно закрутите кистью в течение пяти минут. Затем через пять минут вынуть раствор из тюбика и дважды промыть яйца дистиллированной водой. Затем добавьте приблизительно 100 микролитров 1% раствора хлорида натрия в микроцентрифужную трубку, содержащую яйца.

Сначала склейте два предметных стекла микроскопа вместе, оставив зазор около 0,5 сантиметра для поддержки выравнивания яиц с помощью двусторонней ленты, и нанесите кусок прозрачной пленки на двустороннюю ленту в зазор между слайдами. Затем выровняйте от восьми до 10 яиц одновременно на слайде с помощью кисти. Затем поместите слайд с выровненными яйцами на ступеньку составного микроскопа и удалите 1% раствор хлорида натрия с помощью кусочка безворсовой салфетки, в которой они хранятся.

Прикрепите заполненную инъекционную иглу к микроинжектору, подключенному к микроманипулятору. Затем откройте иглу, аккуратно потирая ее о поверхность яйца, используя настройку высокого давления на микроинжекторе. После того, как игла открыта, уменьшите давление микроинжектора в зависимости от отверстия иглы.

Затем как можно быстрее введите все яйца на горку под углом от 10 до 15 градусов, быстро нажмите ножную педаль и сразу же переместите слайд в условия высокой влажности в чашку Петри влажным бумажным полотенцем. Через пять-шесть часов после помещения слайда, содержащего введенные эмбрионы, в большую чашку Петри, выстланную влажной фильтровальной бумагой, добавьте небольшую каплю дистиллированной воды в прозрачную пленочную повязку с прикрепленными эмбрионами. Затем аккуратно вытесните яйца с помощью кисти.

Далее переложите яйца в небольшую чашку Петри и погрузите их в дистиллированную воду. Держите яйца погруженными в воду, поместите чашку Петри в шестиквартовую пластиковую коробку в инкубаторе при температуре 27 градусов Цельсия при относительной влажности более 90%. Когда личинка начнет вылупляться из введенных эмбрионов через 21-25 дней после инъекции, ежедневно проверяйте их и переносите любых вылупившихся личинок в стеклянные флаконы с экраном сверху.

Результаты показали, что инъекция яйцеклеток в начале эмбриогенеза в возрасте от 12 до 18 часов и выравнивание более длинной оси яйцеклетки перпендикулярно краю слайда приводит к более высокой выживаемости введенных яйцеклеток. Из всех введенных яиц до 8,5% выжили и личинки вылупились. Перед началом этой процедуры важно помнить шаги 2.4, удаление воска с материнского клеща, и шаги с 3.1 по 3.4, размягчение хориона эмбриона хлоридом бензалкония и высыхание эмбриона растворами хлорида натрия, чтобы обеспечить успешную инъекцию эмбриона.

Этот метод был разработан в первую очередь для редактирования генов клещей, и это позволит нам делать нокауты и нокауты, которые помогут нам понять функцию гена клеща. Этот метод позволит использовать инструменты редактирования генов, доступные для многих других организмов, для применения в исследованиях клещей. И это ускорит исследования молекулярной биологии клещей.