Подготовка и структурная оценка монослоев эпителиальных клеток в физиологически размерном микрофлюидном культуральном устройстве

Этот протокол служит для снижения входного барьера для экспериментов с клеточными культурами и позволяет исследователям оценивать и характеризовать адгезивные клеточные монослои, культивируемые в динамических микрофлюидных средах. Основное преимущество этого метода заключается в том, что он позволяет как качественно, так и количественно оценивать характеристики монослоя клеток, что служит основой для дальнейших экспериментов, зависящих от монослоя. Этот метод позволяет рекапитулировать альвеолярный эпителий in vitro, что позволяет исследовать динамические реакции при остром респираторном дистресс-синдроме, ОРДС, а также при поражении легких, вызванном искусственной вентиляцией легких, VILI.

Для начала получите одноканальный массив потоков. Очистите поверхность покровного стекла в ультразвуковой ванне. Погрузите покровное стекло в поли-d-лизин комнатной температуры на пять минут.

Затем высушите его при температуре 60 градусов Цельсия в течение 30 минут. Затем прикрепите двусторонние клеи в майларовые прокладки. Вырежьте лазером, как описано в рукописи, на покровном стекле и убедитесь, что вырезы канала точно выровнены.

Прикрепите прямоугольное покровное стекло к самой нижней клейкой полосе. Используйте очищенную клейкую бумагу, чтобы покрыть части клея, все еще открытые. После завершения сборки приложите к конструкции сильное и равномерное давление.

С помощью шприца, наполненного деионизированной водой, промойте канал. Стерилизуйте корпус канала в ультрафиолетовом стерилизаторе в течение 30 минут. Используя стерильную методику, обработайте канал раствором фибронектина человека, приготовленным в PBS, и инкубируйте не менее 30 минут при температуре 37 градусов Цельсия.

В стерильном вытяжном шкафу с ламинарным потоком приготовьте клеточную суспензию NCI H441 с использованием среды RPMI 1640 с 10% FBS. Используйте 0,25 миллилитра этой суспензии ячеек, чтобы заполнить канал и часть портов. Используя светлопольную микроскопию, убедитесь, что клетки равномерно распределены по каналам.

Добавьте в канал резервуар для мультимедиа и запорный кран. Начните культивирование канала при 37 градусах Цельсия с 5% углекислого газа. Используйте программируемый шприцевой насос для забора отработанных сред из канала и свежих сред в канал из резервуара для стерильного носителя, прикрепленного к входному отверстию канала.

В химическом вытяжном шкафу разбавьте 4%-ный раствор формальдегида в DPBS, чтобы получить 1%-ный раствор, и храните в пробирке с соответствующей маркировкой. Приготовьте 2%-ный раствор формальдегида аналогичным образом. Перелейте растворы формальдегида в пятимиллилитровые шприцы с соответствующей маркировкой.

Наберите 20 миллилитров DPBS в отдельный 20-миллилитровый шприц, который будет использоваться для этапов стирки. Затем удалите микрофлюидный канал из культивального аппарата и закрепите его в химическом вытяжном шкафу. Для сборки фиксирующего и окрашивающего устройства прикрепите отрезок передаточной трубки к боковому отверстию трехходового запорного крана с помощью наружного замка Luer к адаптеру зазубрины шланга.

Затем подсоедините запорный кран к входному отверстию проточной решетки. Прикрепите другой сегмент передаточной трубки к выпускному отверстию существующего запорного крана, используя адаптер для шланга того же типа. Наконец, закрепите свободные концы обеих передаточных трубок, которые теперь обозначены как линии отходов, в контейнер для отходов, соответствующий химическим и биологическим веществам.

Убедитесь, что запорный кран блокирует входное отверстие массива потока, и промойте сливной трубопровод с помощью DPBS. Затем поверните запорный кран, чтобы перекрыть сливную линию, и медленно промойте ячейки двумя миллилитрами DPBS. Медленно протолкните два миллилитра 1%-ного фиксатора через канал.

Оставьте на пять минут и повторите с 2%-ным фиксатором. Затем трижды промойте клетки свежим DPBS, как показано ранее. Приготовьте 0,1%-ный раствор сапонина, как описано в рукописи.

Наберите дополнительные DPBS в шприц объемом 20 миллилитров для использования на этапах стирки. Накройте трубку алюминиевой фольгой. Добавьте в 0,1%-ный раствор сапонина филлоидин нитчатый реагент для окрашивания актина и реагент Хёхста, окрашивающий ядро.

Затем перелейте раствор в шприц, покрытый фольгой. Промойте линию слива небольшим количеством пермеабилизирующего и окрашивающего раствора. Затем вводят два миллилитра раствора в микрофлюидный канал.

Накройте канал алюминиевой фольгой, чтобы заблокировать свет. Через 30 минут промойте пермеабилизирующий раствор двумя миллилитрами DPBS дважды в течение пяти минут каждый, прежде чем осторожно высушить канал. Используя микропипетку, введите минимальное количество мягкого набора антивыцветающего крепления в микрофлюидный канал, чтобы полностью покрыть нижнюю поверхность.

Затем запечатайте конец к каналу. Используя светлопольный микроскоп, быстро проверьте целостность клеточного слоя перед хранением канала в контейнере, чтобы защитить его от света. Проверяйте местоположения изображений, выполняя эталонные сканы и z-стеки до тех пор, пока не будут достигнуты желаемые параметры изображения и условия.

Используя опорную плиту массива потока в качестве эталона, постройте z-стеки в различных местах по длине канала. Наконец, проанализируйте данные поперечного сечения, данные карты глубины и любые другие соответствующие характеристики, чтобы оценить свойства слоя ячейки. Успешное использование метода демонстрируется в микрофлюидной динамической среде культивирования путем получения изображения на расстоянии не менее одного сантиметра от входа и выхода.

В репрезентативном эксперименте по продолжительности культивирования наблюдалось успешное производство монослоя, когда клетки культивировались в течение 24 часов. Однако при культивировании в течение 48 часов было замечено нежелательное многослойное образование. Данные, собранные из каждого из пяти мест визуализации микрофлюидных каналов, также показывают взаимосвязь между увеличением продолжительности культивирования и увеличением площади поперечного сечения, предполагая, что неравномерное формирование слоя или чрезмерный рост происходит в течение 48 часов после культивирования.

Получена карта глубины центрального местоположения в микрофлюидном канале, культивируемом в течение 24 часов, которая полезна для качественной оценки характеристик слоя. Тремя наиболее важными аспектами этого протокола являются правильное построение канала, точные условия культивирования и потока среды, а также осторожное использование аппарата для фиксации и окрашивания. Следуя этой процедуре, другие методы могут быть использованы параллельно для проверки экспериментальной жизнеспособности полученных клеточных монослоев, таких как электрическое измерение импеданса клетки-субстрата, ECIS или трансэпителиальное электрическое сопротивление, TEER.