Индустриализированная лазерная микродиссекция с искусственным интеллектом для микромасштабированного протеомного анализа микроокружения опухоли

Этот протокол интегрирует анализ изображений на основе ИИ для сегментации тканей. С гистологией селективный сбор с помощью лазерной микродиссекции приближает нас к реальности патомики. Предварительное определение рентабельности инвестиций в ткани с использованием ИИ ограничивает время скольжения тканей при температуре окружающей среды, снижает трудозатраты на выполнение этих сборов и снижает изменчивость оператора.

Этот метод широко применим к любым исследованиям, основанным на заболевании или патологии, включая сбор или обогащение конкретных клеточных популяций из образцов тканей. Этот метод прост для пользователей с базовыми знаниями в области гистопатологии и опытом LMD. Ключ в том, чтобы убедиться, что вы вырезаете чистый калибратор для ячеек и хорошо обучаете классификатор.

Для начала убедитесь, что слайд полностью высох, прежде чем резать опорные калибровочные фидуциалы. Откройте программное обеспечение Laser Microdissection и откройте файл sld калибровочной точки по умолчанию под параметром импорта фигур. Загрузите затвор тканью, обращенной вниз, и стороной этикетки ближе к оператору.

В держателе слайда на сцене лазерной микродиссекции выберите опцию автофокуса перед вырезанием. Используя лазерный микроскоп и файл sld калибровочной точки по умолчанию, врежьте фидуциалы калибровки в мембрану PEN. Только для коллекций, обогащенных лазерной микродиссекцией, откройте программное обеспечение для анализа изображений.

Выберите открытые изображения и во всплывающем окне выберите файл изображения dot svs, созданный при сканировании слайда. Перейдите на вкладку аннотаций, выберите и используйте инструмент «Прямоугольная аннотация», чтобы нарисовать прямоугольник вокруг ткани. Выберите аннотацию поля и щелкните правой кнопкой мыши на изображении.

Выберите расширенное раскрывающееся меню, затем выберите параметр секционирования. Установите размер плитки и пространство между 500 и 40 соответственно и нажмите кнопку ОК, чтобы создать плитки. Выберите и удалите аннотацию поля периметра, используемую для создания плиток.

Выберите раскрывающееся меню действий слоя, затем нажмите кнопку «Экспорт», чтобы сохранить мозаичные аннотации в виде файла точечной аннотации. Поместите сохраненную копию алгоритма Python dapa, разработанного для объединения слоев аннотаций, классифицированных AI, в ту же папку, что и файл мозаичных аннотаций. Скопируйте имя файла мозаичной аннотации.

Откройте программу Python с помощью простаивающей интегрированной среды разработки и вставьте имя файла мозаичной аннотации между цитатами в нижней части программы. Выберите раскрывающееся меню запуска, затем нажмите кнопку Запустить модуль. Подождите, пока будет создано несколько файлов, в которых все мозаичные аннотации будут объединены под одним слоем.

Откройте программное обеспечение для анализа изображений и перейдите на вкладку аннотаций. Выберите раскрывающееся меню действий слоя, затем нажмите «Удалить все слои», чтобы удалить все аннотации с изображения. Выберите раскрывающееся меню действий слоя и нажмите «Импортировать локальный файл аннотации».

Во всплывающем окне выберите файл объединенной точечной аннотации, созданный сценарием. Убедитесь, что все импортированные плитки находятся под одним слоем аннотаций. На вкладке классификатора следуйте инструкциям производителя, чтобы выделить репрезентативные области опухоли, стромы и пустого стекла слайдов фона ROI.

Перед запуском классификатора щелкните дополнительные параметры классификатора, выберите нужный уровень аннотаций, установив флажок ROI или поля на вкладке аннотаций. Используйте параметр слоя аннотаций из меню действий классификатора для запуска классификатора. После завершения анализа классификатора перейдите на вкладку аннотаций и выберите слой аннотаций, созданный в результате анализа.

Выберите раскрывающееся меню действий слоя, затем нажмите «Удалить все слои, кроме текущих», чтобы удалить все остальные слои аннотаций с изображения. Затем выберите раскрывающееся меню действий слоя и нажмите кнопку Экспорт, чтобы сохранить аннотации в виде файла точечной аннотации. Создайте папку для сеанса или проекта и сохраните файл точечной аннотации внутри подпапки.

Помечен уникальным идентификатором слайда. Перейдите на вкладку аннотаций, выберите раскрывающийся список действий слоя и нажмите кнопку Удалить все слои, чтобы удалить все аннотации с изображения. Выберите инструмент «Перо» и нарисуйте короткую линию от каждого метода калибровки.

Рисуйте линии из меток в следующем порядке. Вверху слева, сверху справа, внизу справа. Выберите раскрывающееся меню действий слоя и нажмите кнопку Экспорт, чтобы сохранить мозаичные аннотации в виде файла аннотаций do.

Добавьте calib подчеркивания к имени файла и поместите файл во вложенную папку, содержащую координаты для мозаичных фигур. Скопируйте адрес основного проекта. Откройте маллиатор сценария для импорта XML с помощью простаивающей интегрированной среды разработки, а затем вставьте адрес папки проекта между кавычками в нижней части скрипта.

Выберите раскрывающееся меню запуска, затем нажмите кнопку Запустить модуль, чтобы выполнить сценарий. Загрузите отмеченный мембранный слайд с тканью, обращенной вниз, и стороной этикетки ближе к оператору в держатель слайда на сцене лазерного микроскопа. Выберите импорт фигур в раскрывающемся меню файла.

Выберите точечный XML, файл импорта LMD, сгенерированный для слайда. Выберите «Нет» во всплывающем окне, чтобы избежать загрузки опорных точек из файла, и «Нет» во втором всплывающем окне, чтобы избежать использования ранее сохраненных контрольных точек для калибровки. Следуйте подсказкам приложения для лазерного микродиссекции и выровняйте калибровочный крест по каждому из трех калибровочных фидуциалов на слайде.

Найдите фидуциалы калибровки, которые отображаются в левом верхнем, правом верхнем и правом нижнем углу изображения слайда. В программном обеспечении для анализа изображений, которое будет соответствовать опорным точкам перевернутого лазерного микродиссекционного слайда на ступени микроскопа. Переключайтесь между использованием 5-кратного субъективного объектива для определения местоположения и 63-кратного субъективного объектива для выравнивания каждой физической калибровки.

Выберите «Нет» во всплывающем окне, чтобы избежать сохранения опорных точек в файл, и «Окей» во втором всплывающем окне, чтобы убедиться, что слайд вставлен. Переместите 5-кратный субъективный объектив в нужное положение и выберите «Да» во всплывающем окне, чтобы использовать фактическое увеличение. Как только появятся импортированные фигуры, сфокусируйте камеру на ткани.

Выделите и выделите все фигуры в окне списка фигур. Перетащите их на место, используя одну или две аннотации в поле зрения в качестве ссылок, и выровняйте вертикальную ось Z для резки лазером. Загрузите трубки в универсальный держатель для трубок, предназначенный для микротрубок PCT.

Просмотрите импортированные фигуры и назначьте их в соответствующее положение трубки для сбора. Нажмите начать резать, чтобы запустить лазер. Выгрузите и закройте пробу с тканями LMD и положите на сухой лед.

После термоциклирования и центрифугирования LMD собирал образцы тканей, удалял и выбрасывал микроколпачки из микротрубок PCT. Добавьте трипсин, добавьте соотношение один микрограмм на 30 миллиметров квадратной ткани. И вставьте микропестик в микротрубку с помощью инструмента microcap.

Переложите микротрубки в патрон цикла ствола и соберите полный патрон. Поместите патрон в барабанную камеру ствола и закрепите крышку. Цикл ствола при 45 000 фунтов на квадратный дюйм в течение 50 секунд и атмосферное давление в течение 10 секунд при 50 градусах Цельсия в течение 60 циклов.

Для анализа LC-MS MS загрузите флаконы автоматического пробоотборника в соответствующих положениях в автоматический пробоотборник жидкостной хроматографии. Закройте автоматический пробоотборник и проанализируйте отдельные фракции с помощью соответствующего метода градиента и масс-спектрометрии. Неконтролируемая иерархическая кластеризация с использованием 100 наиболее переменных белков.

В результате произошла сегрегация полноценного серозного рака яичников и прозрачно-клеточной карциномы яичников гистотипов от обогащенных лазерной микродиссекцией и цельных опухолевых образцов. Напротив, лазерная микродиссекция обогащала образцы стромы как от полноценного серозного рака яичников, так и от прозрачно-клеточной карциномы яичников. Сгруппированные вместе и независимо от лазерной микродиссекции обогащаются опухолевыми и целыми опухолевыми образцами.

Среди 5 971 количественного белка 215 были значительно изменены между целыми опухолевыми коллекциями из высокодифференцированного серозного рака яичников и образцов карциномы яичников. Из 76 сигнатурных белков, количественно оцененных Хьюзом вообще, 57 были количественно определены в этом наборе данных и были сильно коррелированы Обучение классификатора является наиболее сложной частью. Следуя инструкциям программного обеспечения Indica Lab и уточняя классификатор, мы воспроизводили наиболее точные результаты.

Все остальное стандартизировано. Ткань, собранная с использованием этого рабочего процесса LMD на основе ИИ, совместима с различными последующими аналитическими приложениями, включая протеомику на основе масс-спектрометрии, описанную здесь, или геномный, транскриптомный или другой омический анализ.