Протоколы для CRISPR/Cas9 мутагенеза восточной плодовой мухи Bactrocera dorsalis

Восточная плодовая муха является высокоинвазивным и адаптивным видом вредителей. Эффективные методы исследования функциональных генов могут помочь нам разработать экологически чистые стратегии борьбы с вредителями. Этот метод отличается высокой эффективностью и низкой стоимостью.

Наш протокол послужит полезным руководством по генерации мутантных мух для исследователей восточных плодовых мух. Для начала предсказать структуру генов-мишеней, представляющих интерес, и определить границы между экзонами и интронами с помощью биоинформационного анализа генома Bactroceras dorsalis. Используйте коммерчески доступный набор для синтеза гРНК для генерации разработанной sgRNA.

Повторное суспендирование продукта гРНК в воде, свободной от нуклеаз. Количественно оцените концентрацию с помощью УФ-видимого спектрофотометра и храните при 80 градусах Цельсия перед использованием. Поместите куколки B.dorsalis в пластиковую клетку с условием выращивания 55% относительной влажности, 26,5 градусов цельсия и циклом 14:10 света / день.

Когда взрослые особи выгорают, предоставьте смесь сахара и дрожжей в качестве пищи вместе с водой. Большинство взрослых достигают половой зрелости через 10 дней после появления. Используйте легкую подставку со светом от 30 до 50 люкс для улучшения плодовитости самок, следовательно, повышения эффективности сбора эмбрионов.

Затем поместите 200-сетчатую марлю в камеру яйцекладки, примерно на расстоянии от 1 до 2 миллиметров от крышки камеры. Поместите новую камеру яйцекладки в клетку, когда установка микроинъекции будет готова. Собирайте эмбрионы каждые 10 минут с помощью тонкой влажной щетки и выровняйте их на самодельной инъекционной пластине.

Окуните эмбрионы в галогенуглеродное масло во время инъекции, чтобы избежать дальнейшего высыхания. Готовят рабочий раствор путем смешивания белка Cas9 и соответствующей сгРНК до концентрации 300 нанограмм на микролитр каждого. Затем добавьте 1 микролитр фенольного красного цвета в смесь, чтобы служить удобным способом маркировки введенных эмбрионов.

Поместите приготовленную смесь на лед, чтобы избежать деградации сгРНК. Подготовьте стеклянную инъекционную иглу с помощью съемника микропипетки. Добавьте 3 микролитра смеси в инъекционную иглу без введения пузырьков воздуха.

Затем откройте иглу с помощью Microgrinder и подключите ее к микроманипулятору в соответствии с руководством пользователя. Установите параметры для инжектора как Pi в 500 гектопаскалей. Ti до 0,5 секунды, а PC до 200 гектопаскалей.

Поместите тарелку с выровненными эмбрионами на объективный стол. Затем отрегулируйте положение микропипетки под тонким оптическим микроскопом, установив микропипетку и эмбрион в одну плоскость. Вставьте кончик иглы в задний или растительный полюс эмбриона.

Затем нажмите на педаль от инжектора, чтобы доставить смеси в эмбрион. Появление легкого красноватого цвета обусловлено добавлением в смесь фенол-красного. Поместите инъекционную пластину с введенными эмбрионами в искусственную климатическую камеру.

Через 36 часов переведите вылупившихся личинок в личиночный рацион с помощью мелкоконечной щетки. Собирайте личинок три или четыре раза в день, пока больше личинки не вылупятся. Затем поместите зрелых личинок во влажный песок, чтобы окуклиться.

Стадия окукливания занимает 10 дней. После окукливания переместите куколок в пластиковую клетку до начала эклозии. После выделения геномной ДНК из свежего пупариума или одной средней ноги отдельных взрослых особей и разработки конкретных праймеров для амплификации целевой области, выполняют полимеразную цепную реакцию или ПЦР, следуя условиям циклического цикла, описанным в текстовой рукописи.

Затем чередуйте очищенные продукты ПЦР. Обнаружение нескольких перекрывающихся пиков, прилегающих к целевому участку, предполагает успешный мутагенез. Для субклонирования смешайте очищенные продукты ПЦР с тупым вектором и разложите их при 25 градусах Цельсия в течение 15 минут.

Затем добавьте транс-Т1 клетки и поместите его на лед на 30 минут. Затем добавить 500 микролитров среды LB и инкубировать при 37 градусах Цельсия в течение 1 часа с встряхиванием. Центрифугируйте и выбросьте супернатант.

Повторно суспендируйте гранулу и разложите ее на пластине LB. Поместите тарелку для ночной инкубации при температуре 37 градусов Цельсия. Затем выберите отдельные бактериальные колонии для секвенирования, чтобы проверить генотип мутантов.

В данном исследовании пример целевого участка выбранного гена находится в третьем экзоне. Целевой участок сильно консервирован, и одним гелевым электрофорезом была обнаружена одна полоса для шаблона ДНК для синтетической гРНК и гРНК, полученной in vitro транскрипции. Здесь показаны выживаемость B.dorsalis и мутагенез после микроинъекций.

После секвенирования продуктов ПЦР 80% особей G0 являются мозаичными мутантами. При мутантном скрининге мутант с делецией 8-пар оснований приводил к преждевременному прекращению аминокислотной трансляции. Введение иглы в заднюю область или растительный полюс эмбриона является центральным шагом, потому что это напрямую влияет на выживаемость яйцеклеток.

Эта технология обеспечивает ориентир для изучения областей функций генов у B.Dorsalis Они могут быстро захватывать мутантов, которых они хотят с помощью этого метода.