Платформа вакцины против наночастиц «Plug-And-Display» на основе везикул внешней мембраны, отображающих рецептор-связывающий домен SARS-CoV-2

Нанонаука может эффективно усиливать антиген-специфический иммунный ответ после отображения антигенов на поверхности Основное преимущество в этой вакцинной платформе может достигать выхода бляшки и отображения. Другими словами, платформа способна отображать разнообразие антигенов, этот способ также может быть применен к другим биологическим наночастицам для отображения двигателя на наноразмерных носителях. Чтобы выполнить цитолизин шпионскую катетерную трансформацию, начните с добавления пяти микролитров плазменного раствора к 50 микролитрам компетентного штамма BL 21.

Осторожно поддуть и дать остыть на льду в течение 30 минут. Поместите раствор на 90 секунд на водяную баню при температуре 42 градуса Цельсия, а затем сразу же положите смешанный раствор на лед на три минуты. Добавьте 500 микролитров среды luria bertani в бактериальную суспензию и после смешивания культуры со скоростью 220 оборотов в минуту при 37 градусах Цельсия в течение одного часа.

Далее накладывают всю трансформационную агаровую пластину Лурия Бертани, содержащую ампициллин, и культивируют на ночь при 37 градусах Цельсия. Для производства ловцов-шпионов OMV начните с выделения одной колонии от пластины до 20 миллилитров среды luria bertani и культивируйте в течение ночи со скоростью 220 оборотов в минуту при 37 градусах Цельсия. Инкубировать бактериальный раствор в двухлитровую среду и культивировать со скоростью 220 оборотов в минуту при 37 градусах Цельсия в течение пяти часов до достижения стадии логарифмического роста.

Добавьте изопропил бета D-IPTG, чтобы конечная концентрация бактериального раствора составила 0,5 миллимоляра, а затем культивируйте в течение ночи со скоростью 220 оборотов в минуту при 25 градусах Цельсия. Далее выполните omv spycatcher очистку. Начните с центрирования бактериального раствора.

Отфильтруйте супернатант мембранным фильтром 0,22 микрометра, затем сконцентрируйте его с помощью столба из полого волокна. Отфильтруйте концентрат через мембранный фильтр 0,22 микрометра, затем центри сплавьте его в 150 000 раз G при четырех градусах Цельсия в течение двух часов с помощью ультрацентрового предохранителя и выбросьте супернатант с пипеткой. Повторно приостановите осадки с PBS и храните их при минус 80 градусах Цельсия.

Чтобы выполнить трансфекцию RBD spytag, начните с выбора подходящей системы экспрессии эукариот и культивируйте клетки в течение ночи со скоростью 130 оборотов в минуту при 37 градусах Цельсия после восстановления. Добавьте 20 микролитров HEK 293F клеточного раствора в автоматизированный счетчик ячеек. Запишите количество клеток, отрегулируйте концентрацию в один раз от 10 до шести клеток на миллилитр.

А затем культивируйте клетки со скоростью 130 оборотов в минуту при 37 градусах Цельсия в течение четырех часов. Фильтруйте плазмиду шпионской метки RBD через мембранный фильтр 0,22 микрометра и добавляйте 300 микрограммов плазмид в среду клеточной культуры до тех пор, пока конечный объем не составит 10 миллилитров. Встряхните в течение 10 секунд.

Нагрейте PEI до 65 градусов Цельсия на водяной бане. Смешайте 0,7 миллилитра PEI с 9,3 миллилитрами клеточной питательной среды и периодически встряхивайте в течение 10 секунд. Добавьте плазмидный раствор в раствор PEI.

Встряхните смесь с перерывами в течение 10 секунд и инкубируйте ее при 37 градусах Цельсия в течение 15 минут. Добавьте смесь к 280 миллилитрам клеточной питательной среды и культивируйте со скоростью 130 оборотов в минуту при 37 градусах Цельсия в течение пяти дней. Далее выполните очистку RBD spytag.

Начните с центрирования клеток в 6000 раз G при 25 градусах Цельсия в течение 20 минут и используйте пипетку для сбора супернатанта. Наполните колонку двумя миллилитрами агарозы никеля NTA и трижды промыть ее PBS. Добавьте имидазол в клеточный супернатант, чтобы получить конечную концентрацию 20 миллимоляров, и нагрузите супернатант клетки.

Добавьте три колонки тома PBS, содержащие 20 миллимоларов имидазола для промывки, и соберите промывочную фракцию. Градиентное элюдирование с трехколоночными объемами PBS, содержащими низкие и высокие концентрации элюдазола, элют дважды для каждой концентрации. Для определения концентрации белка методом BCA последовательно разбавляют стандартный белковый раствор BSA от двух до 0,0625 миллиграмма на миллилитр, разводят очищенный ловец OMV и rbD spy tag 10 раз.

Затем смешать рабочие растворы БЦА А и В в соотношении 50 к одному. Добавьте разбавленный белковый раствор и смешайте с рабочим раствором BCA. Инкубировать при 37 градусах в течение 30 минут.

Измерьте поглощение на 562 нанометрах каждой лунки и рассчитайте концентрацию белка по стандартной кривой. Чтобы выполнить биоконъюгацию omv spycatcher и RBD spy tag, смешайте OMV spycatcher и RBD spytag и PBS в соотношении 40 к одному. Вертикально вращайте, чтобы смешать смесь в течение ночи со скоростью 15 оборотов в минуту при четырех градусах Цельсия.

Выполните очистку OMV RBD с использованием раствора PBS с использованием процедуры, аналогичной очистке OMV spycatcher. Схема проектирования плазмы показывает, что ген spycatcher связан с геном cly A через гибкий линкер, в то время как spytag соединяется с пятью основными терминалами гена RBD с геном hys tag для очистки и проверки. После ультрацентрифугирования почти весь нереагированный RBD-шпион остался в супернатанте.

Вторая ультрацентрифугирование не обеспечила дальнейшего существенного преимущества по сравнению с первым разом. Средний гидродинамический диаметр ловца OMV составлял 133 нанометра, в то время как для OMV-RBD он составлял 152,6 нанометра. Эти различия могут быть связаны с тем, что RBD увеличивает размер частиц OMV после интенсивного отображения.

Результаты ТЕА согласуются с распределением частиц по размерам, полученным из результатов DLS. Вращение для смешивания смеси очень важно. Эффективность реакции может быть значительно ниже без вращения.