Измерение сжимаемости клеток и ядер на основе акустофлюидного микроустройства

Клеточная механика играет важную роль в метастазировании опухоли, злокачественной трансформации клеток и радиочувствительности. Акустофлюидный метод позволяет осуществлять быстрое и неразрушающее измерение в взвешенных состояниях. Данная методика может быть использована для зеркального отражения изменения самосжима при эпителиальном переходе в мезенхимальное и разделения циркулирующих опухолевых клеток, показывая перспективы его применения в диагностике рака.

Для начала свяжите блок PDMS с чипом, пробивая отверстия в блоке PDMS для входных и выходных портов полой иглой диаметром один миллиметр. Затем поместите блоки PDMS и чип с задней стороной вверх в плазменный очиститель на одну минуту. После выравнивания отверстий на блоках PDMS с входным и выходным отверстием чипа осторожно прижмите блоки PDMS к чипу в течение 15 секунд, в результате чего между блоками PDMS и поверхностью чипа произойдет склеивание.

Чтобы подключить катетер из PTFE к чипу, отрежьте два куска катетера с внутренним диаметром 0,8 миллиметра и длиной 10 сантиметров. Согните иглу из нержавеющей стали с внутренним диаметром 0,7 миллиметра и длиной 1,5 сантиметра на 90 градусов в L-образную форму и соедините ее с одним концом катетера. Вставьте иглы из нержавеющей стали в отверстия блоков PDMS.

Для входного отверстия подключите дозирующую иглу 19 калибра к другому концу катетера в качестве разъема для шприца. После этого введите деионизированную воду, чтобы проверить герметичность общего канала. Для пьезоэлектрической керамической сборки выбирайте предварительно нарезанные пьезоэлектрические керамические листы шириной пять миллиметров.

Затем свариваем проволоку с обеих сторон пьезоэлектрической керамики на одном конце. Приклейте пьезоэлектрическую керамику к середине задней части чипа, поместив каплю цианоакрилатного клея на пьезоэлектрическую керамику. Разгладьте клей зубочисткой и удалите лишний клей.

Затем быстро нажмите его на чип и продолжайте нажимать около одной минуты. Чтобы смонтировать микроустройство, вырежьте кусок PDMS в качестве основания микроустройства и приклейте одну сторону основания к блокам PDMS, а другую сторону к прозрачному стеклянному слайду с помощью двусторонней ленты. Закрепите все микроустройство на ступени микроскопа, чтобы сохранить чип в одной фокальной плоскости.

Для приготовления растворов стандартных частиц полистирола добавляют 0,05 миллилитра раствора частиц полистирола на 10 миллилитр ПБС и хорошо перемешивают. Затем готовят клеточные суспензии, промывая адгезивные клетки при 90% слиянии с PBS. Добавьте 500 микролитров 0,25 трипсина в течение одной-двух минут при комнатной температуре.

После удаления трипсина добавляют один миллилитр полной среды и образуют клеточную суспензию путем пипетирования. Далее центрифугируют клеточную суспензию при 100 Г в течение пяти минут. Удаляют супернатант и повторно суспендируют в 0,5-одном миллилитре PBS с целью получения клеточной суспензии.

Затем клетки подсчитывали гемоцитометром и концентрация составляла от 300 до 500 000 клеток на миллилитр. После приготовления суспензии клеточного ядра, как показано ранее, удаляют надосадочный агент и добавляют 200 микролитров реагента для экстракции цитоплазматического белка А на 20 микролитр клеточной палитры и хорошо перемешивают. Затем вихрьте вышеуказанную смесь при 220 г в течение пяти секунд и поместите на ледяную ванну на 10 минут.

Далее добавляют 10 микролитров реагента для экстракции цитоплазматического белка В в раствор после инкубации. После вихря поместите на ледяную ванну на одну минуту и снова вихрь при 220 G в течение пяти секунд. Затем, наконец, центрифуга при 1000 G в течение пяти минут при четырех градусах Цельсия.

Удалите супернатант и повторно суспендируйте палитру в одном миллилитре PBS. Затем центрифуга при 1000 G при четырех градусах Цельсия в течение четырех минут. После удаления супернатанта повторно суспендируют в 100 микролитрах PBS в виде суспензии клеточного ядра.

Добавьте трипан синего цвета в суспензию ядра вышеуказанной клетки и окрашивайте при комнатной температуре в течение четырех минут. Далее подсчитайте количество ядер под инвертированным микроскопом с 10-кратным объективом. Разбавляют суспензию ядра вышеуказанной клетки буфером PBS до концентрации от 200 до 300 000 ядер на миллилитр.

Затем отфильтруйте суспензию клеточного ядра через 70-микрометровое сито. Чтобы настроить измерительную систему, включите источник света микроскопа и откройте программное обеспечение камеры. Используйте объектив 4x, чтобы найти среднее положение микроканала, то есть положение пьезоэлектрической керамики.

После соединения проводов приваривайте их к положительным и отрицательным клеммам выходного сигнального генератора из пьезоэлектрической керамики соответственно. Затем поместите шприц на микроинъекционный насос и подключите его к входному катетеру. Чтобы собрать жидкость из микроканала, поместите небольшой контейнер в конце выходного катетера.

Для определения параметров измерения аспирируйте раствор частиц полистирола шприцем. Затем впрыскивайте раствор в микроканал чипа, избегая пузырьков воздуха, и в микроканал чипа для обеспечения точного измерения. Установите выход генератора сигналов на знаковый сигнал с частотой один мегагерц и пиковым напряжением 10 вольт до тех пор, пока не будет замечено, что частицы движутся к средней линии микроканала и остаются в прямом движении вдоль средней линии после достижения средней линии.

После смешивания одной миллилитровой клетки или суспензии ядра со стандартным раствором частиц в соотношении один к одному вводят его в микроканал шприцем для измерения клеток и ядер. Начните запись с помощью ПЗС-камеры, когда клетки или ядра войдут в поле зрения и включите генератор сигналов. Затем промыть микроканал деионизированной водой, 75% спиртом и деионизированной водой последовательно для последующего использования.

Движение клеток и частиц наблюдалось под действием силы акустического поля в сторону средней линии микроканала на разных временных интервалах. Был выполнен расчет энергии, плотности и сжимаемости ячейки, получена плотность акустической энергии и измеренная траектория движения частицы из наилучшего результата подгонки. Высокая чистота и интактные ядра были выделены из клеток, а измерение сжимаемости ядра было достигнуто путем получения траектории движения ядра.

Измеряли и сравнивали сжимаемость различных типов раковых клеток и клеток после медикаментозного ЭМТ или рентгеновского облучения различными дозами. Измеренные клетки были собраны, и было обнаружено, что не было существенной разницы в пролиферации и жизнеспособности клеток по сравнению с необработанной группой после 48 часов культивирования. Указание на то, что измерение сжимаемости не влияет на пролиферацию и выживание клеток.

Самое главное — точно настроить частоту сигнала до тех пор, пока не будет замечено, что частицы движутся к средней линии микроканала.