Гибридная система анализа клеток для оценки структурных и сократительных изменений кардиомиоцитов человека, полученных из iPSC, для доклинической оценки сердечного риска

Метод может помочь ответить на доклинический вопрос, связанный с сердечной безопасностью и токсичностью, используя реальные человеческие данные для безопасного перехода новых кандидатов на лекарства в клинические стадии. Вместо использования набора различных методов in-vitro и in-vivo основным преимуществом этой гибридной системы является одновременная оценка кардиомиоцитов человека, полученных из iPC, электрофизиологических параметров и параметров жизнеспособности, а также анализ сократительных свойств в физиологических условиях. Этот метод может быть применен для открытия лекарственного средства, поскольку он охватывает электрофизиологические, структурные и сократительные изменения кардиомиоцитов и систему с более высокой пропускной способностью, которая позволяет одновременно тестировать 69 скважин.

Чтобы начать покрытие пластины, оставьте нижнюю часть сжимающей пластины закрытой дополнительно поставляемой мембранной защитой до измерения в модуле сократимости. Для посева кардиомиоцитов готовят разбавленный раствор геля EHS путем переноса 2,75 миллилитров готового к использованию раствора геля EHS и 8,25 миллилитров DPBS с кальцием и магнием в стерильную центрифужную трубку. Затем перемешайте раствор.

Снимите мембранную защиту с пластины сокращения. Перенесите приготовленный раствор покрытия в резервуар стерильных реагентов в роботе автоматизации лаборатории. Используйте программу, добавьте 100 микролитров с роботом автоматизации лаборатории и добавьте 100 микролитров раствора покрытия на скважину.

Затем поместите крышку обратно на 96-луночную пластину и высиживайте в течение трех часов при температуре 37 градусов цельсия. После размораживания и подсчета клеток отрегулируйте ячейки в рекомендуемой гальванической среде в соответствии с инструкциями производителя клеток, в результате чего получится 11 раз по 10-шестая клетка на 11 миллилитров для посева всей 96-луночной пластины. Используйте программу удаления 100 микролитров для удаления раствора геля EHS из скважин с помощью робота автоматизации лаборатории.

Затем переложите 11 миллилитров клеточной суспензии в резервуар стерильного реагента, помещенный в робота автоматизации лаборатории, и засейте клетки 100 микролитрами суспензии на лунку. С помощью программы клетки добавляют 100 микролитров. Сразу после посева клеток перенесите гибкую 96-луночную пластину в инкубатор с контролируемой влажностью при 37 градусах Цельсия, 5% углекислого газа, и дайте клеткам осесть на ночь.

Теплые 22 миллилитра поддерживающей среды кардиомиоцитов добавляют к каждой пластине до 37 градусов Цельсия в 50-миллилитровой центрифужной трубке. Через 18-24 часа после посева пластин переложите свежую среду в стерильный резервуар реагентов и оставьте ее рядом с роботом автоматизации лаборатории. Затем выполните удаление среды с помощью программы, удалите 100 микролитров.

Далее поместите резервуар реагента, содержащий свежую среду, в робот автоматизации лаборатории и дозируйте 200 микролитров свежей среды на скважину с помощью программы, добавьте 100 микролитров. Выполните этот шаг дважды, чтобы достичь 200 микролитров на скважину. Сразу после обмена средой переложите пластину в инкубатор.

Выполняйте средний обмен через день до добавления соединения. За четыре-шесть часов до добавления соединения выполняют окончательное изменение среды, перемещая 22 миллилитра свежего и теплого буфера анализа в стерильный резервуар реагентов и оставляя его рядом с роботом автоматизации лаборатории. Сразу после обмена среды перенесите гибкую пластину обратно в инкубатор.

За час до начала базового измерения перенесите пластину на соответствующее измерительное устройство. В управляющем программном обеспечении откройте Edit Protocol и выберите соответствующий режим измерения, Flex Site или Impedance EFP. Определите продолжительность или длину одного измерения до 30 секунд и интервал повторения до 10 минут перед сохранением номера протокола.

Затем выберите Запустить протокол и продолжайте заполнять запрашиваемые поля. Когда параметры будут заданы, выберите Начать измерение. Выполняйте как минимум три базовых измерения с пятиминутными интервалами незадолго до добавления соединения.

Удаляют 50 микролитров пробирного буфера из каждой скважины, не снимая гибкую 96-луночную пластину с измерительного прибора, с последующим добавлением 50 микролитров четырехкратно концентрированного раствора соединения в каждую скважину пластины согласно плану измерений. После добавления соединения выберите маркер добавления реагента для определения компаундной пластины и объема раствора соединения. Затем выберите «Продолжить стандартное измерение» или «Перейти к сериям измерений» в соответствии с экспериментальным планом.

Репрезентативный анализ показывает влияние ингибитора киназы Эрлотиниба на сократимость кардиомиоцитов человека, полученных из iPSC. При самой низкой концентрации Эрлотиниб индуцировал статистически незначимое снижение амплитуды, тогда как микромолярные концентрации Эрлотиниба демонстрировали временное и дозозависимое кардиотоксическое действие. Начало эффекта наблюдалось через 96 часов при приеме одного микромоляра Эрлотиниба, в то время как лечение 10 микромолярами Эрлотиниба приводило к значительному снижению через 24 часа после добавления соединения.

После применения 10 микромолярного эпирубицина клетки переставали биться в течение 24 часов. При применении одного микромолярного эпирубицина резкое снижение амплитуды через 24 ч сопровождалось полным прекращением биения до 48 ч. На 100 наномолярах наблюдалось зависящее от времени уменьшение амплитуды биения.

При самой низкой концентрации 10 наномоляров амплитуда неуклонно колебалась, подтверждая, что эффект эпирубицина был только дозозависимым. Лечение доксорубицином и нифедипином в течение 24 часов снижает жизнеспособность клеток в зависимости от концентрации и времени. При применении повышающих концентраций нифедипина записи потенциала поля на клетках выявляют концентрационно-зависимое укорочение нормируемой длительности поля.

Оценка нифедипина в отношении сократимости сердца также показала значительное снижение амплитуды, зависящей от концентрации, при остром измерении с 10 наномолярными и 13 наномолярными концентрациями. Важно помнить, что клетки, как правило, чувствительны к параметрам окружающей среды, таким как изменения температуры и рН, а также к механическому моделированию, которое особенно поддерживается на пластинах сжатия.