Эффективная трансфекция транскрибированной мРНК in vitro в культивируемых клетках с использованием наночастиц пептид-полоксамин

Пептидно-полоксаминовые наночастицы являются одной из потенциальных легочных систем доставки мРНК. Наш протокол делает пептидно-полоксаминовые наночастицы с более высокой производительностью и эффективностью, что облегчает разработку мРНК-вакцины слизистой оболочки. Материалы, требуемые техникой, являются недорогими, а протокол может быть завершен в короткие сроки.

Пептидно-полоксаминовые наночастицы обладают способностью опосредуть эффективную трансфекцию мРНК. Пептидно-полоксаминовые наночастицы продемонстрировали успешную трансфекцию мРНК в эпителиальных клетках бронхов человека, что предполагает дополнительное применение вакцин против COVID-19 слизистой оболочки, лечение рака легких и генную терапию муковисцидоза. Я ожидаю, что человек будет иметь некоторые базовые знания в смежной области, а также с протоколом и многими методами, прежде чем он или она начнет проводить эксперименты.

После синтеза открытой рамки считывания люциферазы Metridia и клонирования ее в вектор pUC57, подготовьте линеаризованный шаблон ДНК с использованием BamHI и KpnI при 37 градусах Цельсия в течение одного часа. Подготовьте реакцию объемом 20 микролитров для синтеза мРНК с использованием набора транскрипции Т7 и псевдоуридина, как описано в рукописи. Тщательно перемешайте компоненты и инкубируйте при 37 градусах Цельсия в течение трех часов.

Затем удаляют вторичную структуру 50 мкг мРНК IVT без колпачка, нагревая ее при 65 градусах Цельсия в течение 10 минут. Используйте систему укупорки Cap 1 для укупорки мРНК IVT и приготовьте cap 1 путем изменения структуры колпачка 7-метилгуанозина с использованием S-аденозилметионина и 2'O-метилтрансфераз при 37 градусах Цельсия в течение 30-60 минут. Измерьте концентрацию закрытой мРНК IVT с помощью УФ-видимого спектрофотометра.

Используя маркер РНК, проанализируйте молекулярный размер закрытой мРНК IVT в 1% формальдегидно-денатурирующем агарозном геле, содержащем 18% формальдегида. Приготовьте 10 миллиграммов на миллилитр запасного раствора полоксомина 704 путем солюбилизации T704 в воде без нуклеазы. Готовят по 2 миллиграмма на миллилитр запасного раствора пептида путем солюбилизации пептида в воде, свободной от нуклеаз.

Хранить приготовленный раствор при 4 градусах Цельсия. Разморозьте мРНК IVT на льду. Перед открытием трубки центрифугируют трубку в 300 раз G в течение трех секунд при комнатной температуре и разбавляют раствор мРНК IVT водой без нуклеаз.

Готовят T704 и синтетический пептидный смешанный раствор, разбавляя раствор T704 до восьми микрограммов на микролитр концентрации, а синтетический пептидный раствор до 0,555 мкг на микролитр концентрации, водой без нуклеазы, соответственно. Инкубировать смешанный раствор в течение 15 минут при комнатной температуре перед дальнейшим использованием. Втяните раствор мРНК IVT в шприц длиной в один миллилитр, избегая воздушных зазоров или пузырьков в кончике шприца.

Загрузите шприц в одну сторону картриджа рядом с вращающимся блоком. Затем заполните одномиллилитровой шприц раствором T704 и синтетической пептидной смеси и удалите все пузырьки или воздушные зазоры на кончике шприца. Поместите шприц в другое входное отверстие насоса и установите насос с общей скоростью потока от 4 до 10 миллилитров в минуту.

Поместите десятимиллилитровую коническую трубку без РНКазы для сбора смешанного раствора мРНК/PP-sNp IVT в конце пути потока смесительного устройства. Запустите насос, чтобы начать смешивание, убедившись, что параметры введены правильно. После запуска насоса в течение шести секунд соберите образец мРНК/PP-sNp IVT из конической трубки.

Пластинчатость эпителиальных клеток бронхов человека и дендритная клеточная линия в 96-луночных пластинах за 24 часа до трансфекции. Выращивайте клетки в культуральной среде, дополненной 10% термоинактивированной фетальной бычьей сывороткой и 1% пенициллиновым стрептомицином. После удаления питательной среды промыть покрытые клетки по 0,2 миллилитра на лунку PBS.

Добавьте 170 микролитров несывороточной питательной среды к каждой лунке, содержащей покрытые клеточные культуры. Затем добавьте 30 микролитров препарата IVT mRNA/PP-sNp, содержащего 0,4 мкг мРНК Metridia luciferase, в каждую лунку. Инкубируйте клетки с препаратом IVT mRNA/PP-sNp в увлажненной 5%-ной обогащенной углекислым газом атмосфере при температуре 37 градусов Цельсия в течение четырех часов.

Аспирировать трансфекционную среду и добавить 0,2 миллилитра свежей питательной среды, дополненной 10% термоинактивированной фетальной бычьей сывороткой и 1% пенициллином стрептомицином. Инкубируйте трансфектированные клетки в течение 24 часов, как было продемонстрировано ранее, и соберите супернатанты, которые будут обнаружены из каждой скважины. Приготовьте свежий раствор для анализа, добавив PBS в субстрат коэлентеразина.

Тщательно перемешайте раствор путем вихря в течение 10 секунд. Добавьте 50 микролитров собранного супернатанта в 96-луночную пластину. Настройте микропластинчатый считыватель со временем считывания 1000 миллисекунд и добавьте 30 микролитров раствора коэлентеразина в каждую скважину вручную или путем автоматической инъекции.

Сразу после добавления раствора коэлентазина к супернатанту нажмите кнопку Пуск для измерения сигнала люминесценции. Рекомбинантную плазмиду выделяли и переваривали для получения линеаризованного шаблона ДНК. Транскрипция in vitro производила мРНК MetLuc с увеличенной и закрытой крышкой.

Клетки, трансфектированные metridia luciferase mRNA/PP-sNp, показали значительно более высокую экспрессию люциферазы по сравнению с теми, кто трансфектирован коммерчески доступным реагентом трансфекции на основе липидов, голой мРНК Metridia люциферазы, PBS или синтетическими пептидами T7044, смешанным раствором в эпителиальных клетках бронхов человека, 16 HBE и дендритной клеточной линией DC2.4 Metridia luciferase mRNA/PP-sNp показала более высокую экспрессию люциферазы, чем LP. защита мРНК MetLuc от деградации и для повышения эффективности трансфекции экзогенной мРНК Metridia люциферазы. Пожалуйста, убедитесь, что синтетическая структура неограниченной Мет-мРНК успешно удалена. Тщательно рассчитайте и загрузите Met-mRNA T704 и пептидное соединение, чтобы подготовить и уплотнить наночастицы полоксомина.

Просвечивающая электронная микроскопия может быть выполнена для наблюдения за морфологией пептидно-полоксаминовых наночастиц. Этот метод помогает исследователям разрабатывать мРНК-вакцины слизистой оболочки и обеспечивает высокопроизводительный скрининг составов генной терапии для всех связанных клеток.