Построение циклических пептидов с использованием сульфония на тросе

В этом протоколе была построена соль сульфония, которая могла действовать как новая рука, которая реагировала с белком цистеином на особой близости. Преимущество этого метода заключалось в том, что эта реакция была быстрой и эффективной, а Мет-катализатор не содержал и разработал простой и эффективный метод стабилизации пептидов. Для начала приготовьте N-концевой 9-фторинил-метилоксикарбониловый депротекционный раствор 20%-пиперидина или 50%-морфолина и ДМФ в 500-миллилитровом стакане или колбе.

Затем добавьте 10 миллилитров депротекторного раствора в колонку и пузырьковый азот в раствор в течение 30 минут или дважды в течение пяти минут. Слейте раствор вакуумным насосом и последовательно промывайте смолу в течение пяти раз дихлорметаном и N, N-диметилформамидом. Чтобы обнаружить смолу в виде раствора темно-желтого цвета, добавьте один миллилитр N, N-диметилформамида к небольшому количеству смолы и добавьте 200 микролитров 5% нингидрина в стеклянную трубку.

Нагревайте его при 130 градусах Цельсия в течение трех минут, чтобы оценить изменения цвета смолы. Для соединения пептидов готовят смесь раствора, как описано в рукописи, в полипропиленовой трубке и растворяют ее в трех миллилитрах N, N-диметилформамида. Затем добавляют 173 микролитра N, N-диизопропилэтиламин или 154 микролитра N, N'диизопропилкарбодиимида в раствор для инактивации аминокислоты.

Далее добавить смесь в колонку со смолой и в течение двух часов пузырить ее азотом. После соединения добавляют один миллилитр N, N-диметилформамида к небольшому количеству смолы и добавляют 200 микролитров 5% нингидрина в стеклянную трубку. Нагревайте его при 130 градусах Цельсия в течение трех минут, пока смола меняется на бесцветную, что подтверждает отсутствие свободной аминогруппы до стадии депротекции.

После слива раствора промыть смолу, как показано ранее, и добавить в колонку 10 миллилитров раствора для дезащиты. Затем взбейте азотом в течение 30 минут или дважды в течение пяти минут. И снова добавить свежий раствор.

Добавить в колонку 10 миллилитров безводного метанола со смолой для обезвоживания и высушить азотом для следующего использования. Взвесьте 100 миллиграммов смолы в колонну и промыть смолу дихлорметаном и N, N-диметилформамидом перед этапом соединения. Готовят раствор для удаления группы защиты тритил-L-цистеина путем добавления трифторуксусной кислоты, триизопропилсилана и дихлорметановой смеси в 100-миллилитровый стакан или колбу для удаления защитной группы.

Добавить в колонку от пяти до 10 миллилитров приготовленного раствора, чтобы удалить защитную группу на 10 минут. Повторить шесть раз с пузырьками азота до полного исчезновения желтого цвета. После слива раствора вакуумным насосом промыть смолу, как показано ранее.

Затем готовят раствор для взаимодействия с незащищенным цистеином путем добавления дигалогенированного линкера и N, N-диизопропилэтиламин в 50-миллилитровый стакан или колбу с N,N-диметилформамидом. Добавляют от пяти до 10 миллилитров реакционного раствора в колонку для реакции с защищенным цистеином в течение не менее трех часов с пузырьками азота. Опять же, слейте раствор вакуумным насосом и последовательно промывайте смолу, как было показано ранее.

Для приготовления пептидного циклизационного раствора добавляют смесь трифторуксусной кислоты в стакан объемом 20 миллилитров или колбу в вытяжной вытяжке для пептидной циклизации. Затем добавляют от пяти до 10 миллилитров раствора смеси в полипропиленовую трубку и расщепляют смолу под коктейлем трифторуксусной кислоты в течение трех часов. После обезвоживания и промывки смолы перед предварительной демонстрацией стадии соединения готовят 1% водный раствор муравьиной кислоты и один миллимолярный пропаргилбромид и добавляют в раствор пептида метионина.

Далее встряхивают реакцию связи метионина и пропаргилбромида при комнатной температуре в течение 12 часов. После реакции растворяют продукт в полипропиленовой трубке и ацетонитриле и фильтруют его через фильтрующую мембрану размером 0,22 микрометра. Затем немедленно очистите раствор обратной фазой ВЭЖХ и высушите его в порошок для следующего использования.

Синтезированные циклические пептиды с использованием бис-алкилирования между цистеином и метионином характеризовались спектром ВЭЖХ и LCMS, что показывает, что эпимеры демонстрировали различное время удержания и идентичные молекулярные массы. Следы ВЭЖХ эпимеров и его конъюгированного продукта продемонстрировали зависящее от времени превращение между циклическим пептидом и его продуктом. Молекулярную массу циклических пептидов, синтезированных с помощью реакции типа тиол-ин, определяли с помощью LCMS, а пептид выделяли и очищали ВЭЖХ.

Пептиды также характеризовались протонным ЯМР и гетероядерными одиночными квантовыми когерентными спектрами, выявляющими химический сдвиг. Получены протонные ЯМР-спектры зависящего от времени превращения между циклическим пептидом и дитиотрейтолом и оксидом дейтерия для исследования стабильности пептида за счет открытия сульфония кольца. Результаты показали, что через 24 часа не образовывались продукты для сложения или открытия колец.

Эта процедура установила эффективную стратегию синтеза циклических пептидов. Реакция говорит, что селективность также усиливается путем формирования подтверждения, которое стабилизирует пептид циклизации, указывая на то, что циклические пептиды были перспективным лекарственным катализатором.