Обнаружение целей на основе аптамеров, чему способствует 3-ступенчатая G-квадруплексная изотермическая реакция экспоненциального усиления
6 октября 2022 г.
Настоящий протокол демонстрирует использование быстрого 3-ступенчатого анализа экспоненциального усиления на основе аптамеров для обнаружения целей. Подготовка образцов, усиление сигнала и проявление цвета рассматриваются для реализации этой системы для распознавания присутствия теофиллина по сравнению с присутствием кофеина.
Этот метод предлагает способ усиления сигнала от событий связывания в форму, которая обнаруживается визуально при низком использовании ресурсов или может быть количественно определена с помощью приборов на основе поглощения. Это относительно быстрый протокол с одним горшком для определения присутствия мишени аптамера в интересующей выборке. Результаты могут быть сопоставлены со стандартной калибровочной кривой, если требуется количественная оценка.
Люди должны быть очень аккуратными при переносе и смешивании растворов, так как недостаточное смешивание приведет к отрицательным результатам. Кроме того, следите за тем, чтобы реагенты и растворы оставались охлажденными до использования, чтобы свести к минимуму фоновый сигнал. Начните с активации продуктов расщепления рибозима путем добавления пяти единиц полинуклеотидкиназы Т4 в пробирку для ПЦР.
Затем добавьте один микролитр предварительно подготовленного 5-кратного буфера рибозима в каждую пробирку для образцов. Чтобы визуально продемонстрировать специфичность, добавьте 1,5 микролитра двухмиллимолярного теофиллина или двух миллимоляров кофеина в каждую пробирку для образца в качестве исследуемых образцов и тщательно перемешайте каждый образец путем пипетки от пяти до 10 раз. Затем добавляют два микролитра 600 наномолярной РНК, содержащей целевой аптамерный домен, в каждую пробирку с образцом, а затем пипетируют для быстрого смешивания компонентов.
Теперь поместите трубку на холодный блок, чтобы свести к минимуму фоновый сигнал. После подготовки всех реакционных пробирок инкубируйте каждый образец при комнатной температуре ровно три минуты. По окончании инкубации немедленно верните пробирки с образцом в лед.
Добавьте 3,5 микролитра ферментной смеси никазполимеразы в каждую пробирку для образца и хорошо перемешайте. Затем добавьте 31,5 микролитра реакционной смеси EXPAR, содержащей матричные нуклеотиды и реакционный буфер, в каждую пробирку для образцов и перемешайте пипеткой. После того, как все образцы будут подготовлены, инкубируйте подготовленный образец при температуре 55 градусов Цельсия в течение пяти минут с помощью таймера.
Сразу же верните пробирки с образцами в лед после инкубации. Добавьте два микролитра раствора гемина в каждую пробирку для образца для проявления цвета и хорошо перемешайте. Затем добавьте 58 микролитров коммерчески доступного раствора TMB в каждую пробирку с образцом, хорошо перемешайте и инкубируйте для проявления цвета.
Качественно считайте образцы на глаз или количественно оцените результаты с помощью считывателя абсорбционных пластин, как описано в рукописи. Оптимизированная конструкция может распознавать всего 500 наномолярных теофиллинов за 30 минут. Препараты образцов, подвергшиеся воздействию мишени, дают синий цвет, в то время как образцы, не содержащие мишени, остаются бесцветными.
Стандартная кривая была подготовлена из сигнала, измеренного на A450 после 30 минут проявления цвета. Важно держать образцы на льду, когда они не проводят инкубацию, так как даже оптимизированная РНК все равно будет демонстрировать низкий уровень фоновой активности.
Просмотрите полный транскрипт и получите доступ к тысячам научных видео
Обзор
Этот протокол демонстрирует быструю, 3-этапную, аптамер-базирующуюся экспоненциальную амплификационную пробу для обнаружения таких мишеней, как теофиллин. Он включает подготовку образца, усиление сигнала и развитие цвета.
Ключевые компоненты исследования
Область науки
- Биохимия
- Аналитическая химия
- Биотехнология
Фон
- Аптамеры - это короткие одноцепочечные молекулы РНК или ДНК, которые могут связываться с определенными мишенями.
- Усиление сигнала важно для обнаружения мишеней с низкой концентрацией.
- Методы визуального обнаружения могут быть полезны в условиях с ограниченными ресурсами.
- Точное обращение с реагентами важно для точных результатов.
Цель исследования
- Разработать быстрый метод обнаружения теофиллина по сравнению с кофеином.
- Предоставить однопоточный протокол для усиления сигнала.
- Обеспечить количественное определение результатов с использованием калибровочной кривой.
Используемые методы
- Активация продуктов расщепления рибозима с полинуклеотидкиназой Т4.
- Визуальное обнаружение событий связывания.
- Количественное определение с использованием абсорбационной аппаратуры.
- Тщательное смешивание и охлаждение реагентов для минимизации фонового сигнала.
Основные результаты
- Метод позволяет обнаруживать теофиллин в образцах.
- Результаты можно визуально интерпретировать или количественно определять.
- Точность обращения с растворами является критичной для успешных результатов.
- Фоновые сигналы могут быть минимизированы при правильном управлении реагентами.
Выводы
- Аптамер-базирующийся анализ является быстрым и эффективным методом для обнаружения мишеней.
- Его можно адаптировать для различных применений в условиях с ограниченными ресурсами.
- Будущие исследования могут изучить дополнительные мишени и оптимизацию протокола.
Часто задаваемые вопросы
Executive Industry Relevance
Aptamer-based detection systems with isothermal exponential amplification offer rapid, sensitive, and visually interpretable outputs for target validation in early discovery workflows. This three-stage G-quadruplex amplification protocol enables both qualitative and quantitative readouts, supporting robust decision-making at the assay development and screening inflection points. The approach enhances predictive confidence for target engagement and specificity, directly impacting portfolio triage and downstream assay readiness.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables direct interrogation of molecular recognition events using aptamer specificity.
- Supports functional validation of target binding through visually detectable outputs.
- Facilitates rapid assessment of target engagement for mechanistic de-risking.
- Improves confidence in target selectivity by distinguishing closely related analytes.
Screening & Assay Development
- Provides a standardized, one-pot protocol for reproducible assay setup.
- Delivers quantitative outputs via absorbance measurement for reliable compound evaluation.
- Enables rapid screening of samples with minimal instrumentation requirements.
- Supports calibration curve-based quantification for assay standardization.
Translational & Preclinical Research
- Offers potential for adaptation to disease-relevant biomarkers when supported by aptamer design.
- Maintains continuity from discovery to preclinical validation through scalable detection formats.
- Reduces risk of false positives by minimizing background signal with optimized protocols.
Pipeline & Workflow Integration
This aptamer-EXPAR system fits within the early discovery to lead identification continuum, providing a bridge from molecular recognition to quantitative assay development.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by confirming target presence and specificity.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative outputs suitable for high-throughput or resource-limited settings.
- Analytics: Enables absorbance-based measurement and standard curve generation for comparative analysis.
- Translational Research: Can be adapted for biomarker detection if aptamer specificity is established.
- Enterprise Reuse: Protocol modularity allows adaptation to new targets by substituting aptamer domains.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in target validation.
- Operational Value: Streamlines workflows with a rapid, standardized, and scalable protocol.
- Strategic Value: Enables faster go/no-go decisions and capital-efficient assay development.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization by providing robust, quantitative detection data.
Implementation Considerations
- Requires expertise in aptamer design and nucleic acid handling.
- Needs access to basic molecular biology instrumentation and absorbance plate readers for quantification.
- Demands precise reagent handling and temperature control to minimize background signal.
- Protocol can be adapted to different targets by modifying the aptameric domain.
- Careful optimization is necessary to ensure specificity and minimize false positives.
