Лазерно-индуцированные измерения потенциала действия кардиомиоцитов на микроэлектродных массивах для повышения предсказуемости фармакологии безопасности

Этот метод позволяет регистрировать внутриклеточные подобные потенциалы действия на традиционных MEA'S, тем самым позволяя лучше описать форму AP и более чувствительную классификацию проаритмических потенциалов. По сравнению с типичными записями потенциала поля внутриклеточные фактические потенциальные формы обеспечивают более глубокое понимание точной авторизации нижележащих ионных каналов. При применении к кардиомиоцитам, полученным от клинических пациентов с помощью технологии стволовых клеток, метод может способствовать причинно-следственной диагностике и персонализации C R P и сердечных заболеваний, таких как аритмии Наш техник Карин Гебхардт продемонстрирует культивирование кардиомиоцитов.

Чтобы начать покрытие электродных полей ранее автоклавных МЭА, Dropwise фибронектином использует пипетку объемом 10 микролитров под ламинарной вытяжкой. Чтобы уменьшить осмотический шок, переведите по каплям раствор по каплям в течение 90 секунд в 50-миллилитровую трубку, содержащую отягощенные кардиомиоциты. Аккуратно добавьте восемь миллилитров гальванической среды в трубку и тщательно перемешайте клеточную суспензию.

Используя 10-миллилитровую пипетку, удалите супернатант, убедившись, что гранула не выбросит и отрегулируйте номер ячейки до конечной концентрации. Перед посадкой ячейки удалите нанесенный раствор покрытия из области электрода MEA с помощью пипетки 10 микролитров. Чтобы избежать высыхания покрытия, засейте ячейки немедленно, добавив четыре микролитра ячеек по каплям на электродные поля для обоих, шести скважин MEA и одной лунки M E A. Теперь позвольте ячейкам прилипать к скважинам в течение одного часа при 37 градусах Цельсия и 5% углекислого газа.

Под ламинарный проточный капот добавьте 200 микролитров и один миллилитр стерильной гальванической среды, нагретой до 37 градусов Цельсия для шести скважин MEA и одной скважины MEA соответственно. Для записи MEA поместите систему MEA поверх устройства с держателем микросхемы MEA, центрированным над отверстием объектива. Затем позвольте лазеру сфокусироваться на электродах, расположив установку MEA таким образом, чтобы цель находилась непосредственно под отверстием системы MEA.

Чтобы позволить клеткам восстановиться после механического возмущения, перенесите чип MEA с культивируемыми клетками из инкубатора в установку MEA за 15 минут до записи. Затем тщательно очистите контактные прокладки и штифты, используя мазок изопропанола, чтобы снизить уровень шума. Осторожно поместите MEA в установку MEA и расположите шестилуночный микросхему MEA с серийным номером, видимым с правой стороны, или микросхему MEA с однолуночным MEA-чипом с опорным электродом слева.

Теперь установите интегрированную систему MEA на 38 градусов по Цельсию. Закройте крышку устройства, так как встроенный предохранительный выключатель позволяет активировать лазер только в том случае, если крышка закрыта над микросхемой MEA. С помощью программы конфигурирования MEA установите системный фильтр MEA высоких и нижних частот на 0,1 герц или менее и 3 500 герц соответственно.

Используйте программное обеспечение стойки MC или любое альтернативное программное обеспечение для записи. Отрегулируйте входной диапазон в соответствии с экспериментом. Обеспечение того, чтобы сигнал не насыщал усилитель и частоту дискретизации.

Используйте функцию долгосрочного отображения программного обеспечения для проверки записи. После вставки микросхемы MEA в настройку MEA и настройки программного обеспечения инициализируйте лазерную механику с помощью программного обеспечения FB ALP. Теперь нажмите на кнопку инициализации.

В конце инициализации виртуальная лазерная точка будет находиться в скважине D для шести скважин MEA и в левом нижнем углу для одной скважины MEA соответственно. Затем с помощью клавиши управления щелчком мыши переместите виртуальную лазерную точку в середину D пяти электрода и отрегулируйте фокус, удерживая клавишу управления и прокручивая колесом мыши. Кроме того, можно использовать функцию автофокусировки.

Нажмите кнопку набора P one, и виртуальная лазерная точка автоматически переместится в скважину F.Система теперь выровнена. Отрегулируйте мощность лазера и время обработки в соответствии с экспериментальными требованиями. Чтобы включить лазер, нажмите на кнопку выключения лазера, которая будет отображаться как лазер включен, Переключитесь на программное обеспечение для записи.

Выберите имя файла и нажмите на красную кнопку записи, а затем кнопку воспроизведения в верхней части окна, чтобы записать измерение. Перед открытием ячеек лазером записывают базовую линию в течение 60 секунд. Вернитесь к программному обеспечению инициализации и деактивируйте электроды, которые будут исключены лазером на виртуальной карте в правой части окна программного обеспечения.

Для запуска лазера используйте Alt щелчок мышью, и выберите центральный электрод этого колодца. Это инициирует лазер для автоматического открытия ячеек на каждом электроде этой скважины, повторите для каждой скважины, чтобы открыть все ранее активированные электроды этой выбранной скважины. Растворяют миллимолярную концентрацию нифедипина Е-40 31 и дофетилида сначала в ДМСО, а затем в полной среде до 10-кратной желаемой концентрации.

Никогда не превышайте конечную концентрацию ДМСО 0,1% в скважине. Запишите базовую активность в течение 60 секунд. Запустите лазерную индуцированную перацию, как показано ранее, что приведет к преобразованию FPS в liAP.

Применяют все препараты в разовой концентрации на лунку. Удалите 20 микролитров и 100 микролитров среды на скважину из шести скважин и одной скважины MEA соответственно. Добавьте 20 микролитров или 100 микролитров исходного раствора препарата для измерения в лунку.

В зависимости от типа MEA и осторожно пипеткой вверх и вниз два-три раза. Дайте соединениям промыться в течение 300 секунд. За это время форма liAP может трансформироваться в форму FP.

Опять же, индуцированная лазерно-индуцированная перация и запись возможных дефектов, индуцированных соединениями, на liAP в течение дополнительных 60 секунд. Добавление нифедипина уменьшало фазу плато liAP в зависимости от концентрации и, таким образом, укорачивало весь liAP. Это укорочение было сопоставимо с полевыми потенциалами кардиомиоцитов от неманипулированных электродов.

Е-40 31 ингибировал реполяризацию соответствующих КВ в одной точке 11 калиевых каналов и приводил к аритмическому поведению кардиомиоцитов при повышенных концентрациях. Кроме того, E-40 31 увеличивал продолжительность liAP в зависимости от концентрации. В конце liAP наблюдались небольшие положительные отклонения напряжения на 0,1 микромоляра, которые стали более заметными с более высокими концентрациями, что указывает на переходную новую деполяризацию, называемую EAD.

При самой высокой концентрации 0,1 микромоляра эти EAD со временем переросли в эктопические удары. Которые являются потенциалами преждевременного действия. EAD и эктопические удары являются ключевыми показателями проаритмической активности.

И в конце концов, электрическая активность приводит к аритмическому биению. Отношения реакции концентрации коррелировали с записями FP и liAP. Кроме того, в присутствии дофетилида как FP, так и liAP отображали продолжительность примерно двух секунд в пределах одной и той же скважины, форма сигнала FP представляла регулярные отклонения реполяризации.

В то время как в liAP EAD обнаруживаются. Важно настроить фокус перед каждым меломеном, так как изображение вне фокуса микроскопа может повлиять на открытие клеток. Кроме того, потенциал действия принимается вскоре после того, как оптэрперация должна быть использована для анализа.

Этот метод более чувствителен при обнаружении предшествующих аритмических эффектов по сравнению со стандартным МЭА, что позволяет более точно выявлять неблагоприятные составные эффекты.