Решение практических вопросов микроиндентирования на основе атомно-силовой микроскопии на эксплантах суставного хряща человека

Целью данного протокола было создание модели in vitro для изучения механических свойств суставного хряща в период возникновения и прогрессирования остеоартроза. Основное преимущество данной методики заключается в том, что хрящевые экспланты легко генерируются и очень репрезентативны для хряща нативного возраста. Эта модель может быть использована для анализа и мониторинга различных остеоартрозных, диагностических и терапевтических подходов на биомеханическом уровне.

Для начала отрежьте хрящ от кости с помощью скальпеля. С помощью биопсийного перфоратора сгенерируйте диски диаметром четыре миллиметра. Поместите диск на изготовленное по индивидуальному заказу режущее устройство.

С помощью шпателя зафиксируйте и стабилизируйте хрящевой диск. Разрежьте хрящевой диск лезвием бритвы. С помощью шпателя соберите диск и поместите его в пробирку объемом 1,5 миллилитра.

Чтобы остаться в образцах хряща, добавьте 130 микролитров проницаемого для клеток флуоресцентного красителя в каждую лунку 96-луночной пластины и распределите диск на пластине как один диск на лунку. Поместите планшет 96 лунок на держатель пластины флуоресцентного микроскопа. Выберите подходящий флуоресцентный фильтр и объектив.

Поместите объектив под предварительно выбранную лунку, содержащую отдельные хрящи. Сосредоточьтесь на диске, чтобы увидеть клеточный рисунок. Выберите функцию навигатора, чтобы получить обзор всей скважины.

Используйте левую кнопку мыши и перетащите ее, чтобы перейти в другую позицию. Выберите квадрат, охватывающий область интереса для сканирования. Выберите параметр точки карты фокусировки программного обеспечения, а затем выберите каждую отдельную плитку, щелкнув левой кнопкой мыши в ее центре.

В появившемся окне выберите вариант карты фокусировки со всеми ранее выбранными плитками. Дважды щелкните плитку, чтобы отобразить ее и сфокусироваться. Затем нажмите кнопку Set Z, чтобы сохранить фокальный план, и перейдите к следующему фрагменту.

После настройки фокального плана для каждой отдельной плитки начните получение изображения, нажав кнопку «Начать сканирование». Закрепите каждый предварительно выбранный хрящевой диск, содержащий клеточный рисунок, в чашках Петри, добавив достаточное количество биосовместимого клея на верхнюю, нижнюю, левую и правую стороны диска. Залейте диски 2,5 миллилитрами лейбовицкой среды без L-глютамина.

Поместите чашку Петри в держатель образцов устройств АСМ. Чтобы откалибровать консоль АСМ, поместите ее на поверхность консоли стеклоблока так, чтобы она опиралась на полированную оптическую плоскость в центре стеклоблока. Опустите консоль с шагом 100 микрометров с помощью функции шагового двигателя до полного погружения в среду.

Чтобы определить желаемое место измерения хряща, начните сканирование с помощью кантилевера на чистом участке чашки Петри, свободном от образцов. Затем отодвиньте консоль на 1,5 миллиметра от нижней части пластины. Переключитесь с яркого поля на флуоресцентный вид и визуально определите верхнюю часть диска.

Сдвиньте держатель образца АСМ ровно на два миллиметра к середине диска. Запустите сканирование, чтобы добраться до поверхности хрящевого диска и втянуть кантилевер на 100 микрометров. Чтобы построить кривую силового расстояния, сфокусируйтесь на ячейках, расположенных в нужной точке измерения.

Нажмите кнопку «Выполнить», чтобы начать измерения и получить пять кривых силового расстояния в каждой точке измерения. Сохраняйте кривые после их проверки. Чтобы оценить модули Юнга, с помощью опции открыть пакет спектроскопических кривых откройте сгенерированные кривые силовых расстояний для анализа.

Выберите модель с подгонкой по Герцу, а затем с подгонкой по эластичности. Затем визуализируйте и задокументируйте модуль Юнга. Адаптируйте, используя коэффициент Пуассона 0,5 и соответствующий радиус кончика кантилевера.

Затем визуально проверьте подгонку кривой силового расстояния, чтобы убедиться в правильности. Для определения глубины вдавливания откройте каждую из сгенерированных кривых силового расстояния в программном обеспечении для анализа данных и выберите модель Hertz-fit в качестве процесса анализа. Примените параметр смещения базовой линии для обнуления оси вертикального отклонения и выберите функцию смещения плюс наклон.

Используйте функцию поиска точки контакта для автоматического определения точки контакта. Используя функцию вертикального положения зонда, вычтите расстояние, учитывающее исключительно отклонение кантилевера, из необработанной высоты пьезо во время отступа. Выберите параметр эластичности, чтобы отобразить обработанную кривую расстояния по силе.

Затем выделите область графика так, чтобы она совпала с самым отрицательным значением на вертикальной оси положения наконечника. На вкладке параметров в поле XMIN прочтите и задокументируйте отступ. Диски, содержащие одинарные струны, показали более высокие значения жесткости со средним значением 2,6 килопаскаля, что является репрезентативным для бескомпромиссных, здоровых участков хряща.

С началом и прогрессированием остеоартроза измерения АСМ показали сильное ступенчатое снижение жесткости на 42% в двойных струнах, на 77% в небольших кластерах и, в конечном счете, на 88% в поздних стадиях, представленных большими кластерами. Диски, содержащие диффузный рисунок, демонстрируют повышенную упругость с важным изменением единичных значений модуля Юнга. Было обнаружено, что для всех хрящевых дисков с преобладающей организацией клеточного рисунка глубина вдавливания, связанная с используемой установкой, обратно пропорциональна жесткости.

Артефакты, наблюдаемые на сгенерированных кривых силовых расстояний, указывают либо на неоптимальный контакт между кантилевером АСМ и поверхностью хряща, либо на неправильную фиксацию образца в чашке Петри. Наши хрящевые эксплантаты могут быть дополнительно обработаны и проанализированы с использованием различных молекулярно-биологических методов, таких как анализ белка с помощью ИФА, иммунометирование, вестерн-модинг или генный анализ с помощью ПЦР. Этот метод может быть использован для изучения прямого воздействия новых методов лечения на суставной хрящевый сустав и может помочь исследователям получить важные сведения о потомских механизмах остеоартрита.