Оценка бивентрикулярной функции мышей ex vivo в модели Лангендорфа
23 декабря 2022 г.
Здесь представлен протокол для достоверной количественной оценки функции правого и левого желудочков донорских сердец после холодоконсервации с использованием системы перфузии ex vivo .
С помощью описанного протокола мы можем сравнить левый желудочек донорского сердца и функцию желудочков после консервации, а также изучить различия в биологии сохранения в обоих желудочках во время процесса консервации. Этот метод использует перфузионную систему ex vivo для изучения функций сердца после консервации. Он предоставляет прочные и надежные инструменты для скрининга новых методов лечения для улучшения функций донорского сердца после консервации.
Начните с приготовления теста, как описано в тексте, и сформируйте из небольшого кусочка теста овальную форму, чтобы получилась головка. Прикрепите его к концу сухой пряди спагетти. Опустите головку в уже приготовленный сахарный раствор и медленно выньте ее, как только она хорошо покроется тонкой пленкой раствора.
Затем подвесьте нить спагетти на пенополистирольном блоке или других держателях, чтобы на голове образовался ровный и глянцевый покров, и высушите его в течение ночи. На следующий день окуните форму в силиконовый эластомер, диспергированный в ксилоле, и поместите нить спагетти обратно в пенополистирольный блок при температуре 37 градусов Цельсия на два часа или до полного высыхания. Повторите этот шаг еще раз.
Затем поместите форму в воду, чтобы отделить и собрать воздушный шар. Храните баллон в 0,02% азиде натрия. Теперь отрежьте два тупых конца от иглы 22-го калибра и прикрепите один тупой конец к силиконовому баллону, а другой тупой конец к полиэтиленовой трубке.
Используйте шелковый шов 4-0, чтобы завязать баллон на месте на игле. Возьмите мышь C57Black/6 и внутрибрюшинно введите 200 единиц гепарина в брюшную полость животного для антикоагулянтного действия. Убедившись в правильности анестезии щипком пальца ноги, сделайте разрез прямо под грудиной.
И с помощью ножниц вскрыть грудную клетку, перерезав диафрагму в ребрах. Затем согните переднюю грудную стенку, чтобы полностью обнажить грудную клетку, прежде чем сделать надрез на нисходящей аорте рядом с дугой аорты. Теперь перенесите сердце, легкие и тимус мыши в ледяной гистидин-триптофан-кетоглутарат, или буфер HTK, чтобы изолировать органы.
Обнажите аорту, удалив соединительную ткань. Соедините конец аорты с иглой 22-го калибра и перевяжите шелковым швом 6-0. Убедитесь, что канюля находится выше корня аорты, чтобы не мешать аортальному клапану.
Пропитайте аорту в течение примерно 10 минут 10 миллилитрами буфера HTK, предварительно охлажденного до четырех градусов по Цельсию. В зависимости от типа эксперимента, либо храните сердце в 50-миллилитровой пробирке с ледяным HTK в течение восьми часов, либо сразу же проводите профузию. Чтобы выполнить пролитие, соедините игольчатое сердце с канюлей в аппарате Лангендорфа и перевяжите его шелковым шовом.
Начните обливание в режиме постоянного потока со скоростью три миллилитра в минуту, а затем, перейдя в режим постоянного давления при 70-80 миллиметрах ртутного столба, отрегулируйте скорость перфузии примерно до шести миллилитров в минуту. Далее подсоедините сдутый силиконовый баллон, наполненный водой, к датчику давления и шприцу, наполненному водой, с помощью трехстороннего крана. Через 15-20 минут периода равновесия после предыдущей перфузии разрежьте правое предсердие, или РА, и введите баллон в правый желудочек, или ПЖ, через РА. Используйте ленту, чтобы удерживать баллон внутри фургона и свести к минимуму открытую область РА, чтобы помочь удерживать баллон в желудочке.
После 20 минут сбора функциональных данных для ПЖ разрежьте левое предсердие, или ЛП, и введите сдутый баллон, наполненный водой, в левый желудочек (ЛЖ) через ЛПЖ. Используйте скотч, чтобы удерживать баллон внутри LV.To откалибруйте датчик давления, сначала наполните шприц объемом 10 миллилитров теплым физиологическим раствором и подсоедините шприц к куполу через трехсторонний кран. Откройте кран и медленно наполните купол физиологическим раствором, прежде чем закрыть все краны и вынуть шприц. Затем прикрепите заполненный купол к датчику, подключив манометр к третьему концу трехходового крана.
В программном обеспечении для записи в выпадающем меню канала, подключенного к преобразователю, выберите опцию Bridge Amp. Нажмите на 0 перед началом записи, чтобы установить показания датчика на ноль миллиметров ртутного столба. После нескольких секунд записи медленно надавите на шприц и увеличьте давление до 100.
Нажмите кнопку Стоп, чтобы завершить запись. В диалоговом окне «Преобразование единиц измерения» выберите область записи для ноль миллиметров ртутного столба и щелкните стрелку на 1 перед вводом ноль миллиметров ртутного столба. Аналогично выберите область записи для 100 миллиметров ртутного столба.
Щелкните стрелку на 2 и введите 100 миллиметров ртутного столба. Теперь нажмите кнопку ОК, чтобы откалибровать датчик. После того, как калибровка будет выполнена, переименуйте канал, соответствующий датчику давления с баллоном, в «Давление в желудочках» или «Давление ЛЖ» и начните запись, когда сердце будет подключено к системе.
После введения баллона в желудочек отрегулируйте объем воды в баллоне с помощью шприца микрометра через трехсторонний кран, чтобы поддерживать конечное диастолическое давление на уровне от пяти до 10 миллиметров ртутного столба. Затем переименуйте пустой канал в dP/dt и оставьте производный исходный канал в качестве давления в желудочке. Этот канал регистрирует коэффициент изменения давления в полости желудочка во время сокращения.
Выберите стабильный период измерения перед переходом к настройке в модуле артериального давления. Затем выберите низкое давление в качестве входного канала и нажмите кнопку выбора, прежде чем нажать OK. Теперь щелкните Классификатор (Classifier View), чтобы удалить все выбросы сердечного цикла, и Табличный вид, чтобы создать таблицы для среднего значения максимального dP/dt и минимального dP/dt за выбранный период. Когда сердце мыши хранилось в буфере HTK в течение ноль часов до перфузии, для ЛЖ было зарегистрировано более высокое систолическое давление по сравнению с ПЖ. Кроме того, по сравнению с RV, LV также демонстрировал значительно большее мышечное сокращение, а также расслабление.
Однако, когда перфузия была проведена на сердце после того, как оно было подвергнуто восьмичасовому хранению в холодильнике, как ЛЖ, так и ПЖ показали значительное функциональное снижение по сравнению со стадией нулевого часа. Снижение было более выраженным в ЛЖ по сравнению с ПЖ. Сокращение и расслабление ЛЖ после восьмичасового хранения составляло 25,1% и 30,7% от функции, соответствующей нулевому часовому хранению, в то время как РП показывал 32,5% и 29,1% функции, по сравнению с нулевым исходным уровнем. Признаки первичной дисфункции трансплантата ЛЖ после длительного хранения были более значимыми, чем у ПЖ. Качество сохранности во многом зависит от перфузии ГТК.
Важно убедиться, что перфузия последовательна, чтобы точно сравнивать различные методы лечения. Благодаря точному измерению функции донорского сердца, этот метод может быть легко адаптирован к скрининговым препаратам, которые могут улучшить функцию донорского сердца, а затем дополнительно валидировать с использованием гетеротопной модели трансплантации.
Обзор
В данном протоколе подробно описан метод количественной оценки функции правого и левого желудочков донорских сердец после холодного консервирования с использованием системы ex vivo перфузии. Этот метод позволяет сравнивать функцию желудочков после консервирования и изучать биологические аспекты процесса сохранения органов.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Физиология сердечно-сосудистой системы
- Биология трансплантации
- Методы перфузии сердца ex vivo
Теоретические сведения
- Понимание функции донорского сердца имеет решающее значение для успешной трансплантации.
- Холодное консервирование влияет на физиологические свойства желудочков сердца.
- Система ex vivo перфузии обеспечивает контролируемую среду для проведения оценки.
- Сравнительный анализ функций левого и правого желудочков может помочь в определении стратегий лечения.
Цель исследования
- Для надежной количественной оценки функции желудочков после холодного консервирования.
- Для изучения различий в эффектах консервирования левого и правого желудочков.
- Для разработки надежного метода скрининга методов лечения с целью улучшения функции донорского сердца.
Используемые методы
- Подготовка донорских сердец с использованием буфера HTK для консервации.
- Перфузия сердец ex vivo для оценки функциональных параметров.
- Установка датчиков давления для измерения давления в желудочках.
- Сбор данных и анализ показателей систолической и диастолической функций.
Основные результаты
- В левом желудочке зафиксировано более высокое систолическое давление по сравнению с правым желудочком.
- Левый желудочек продемонстрировал более выраженное сокращение и расслабление мышц, чем правый желудочек.
- Влияние продолжительности холодного хранения на функцию желудочков было значительным.
- Сбор функциональных данных позволил получить представление о биологии консервации.
Выводы
- Данный протокол представляет собой надежный метод оценки функции донорского сердца.
- Были выявлены различия в реакциях левого и правого желудочков на консервацию.
- Это исследование способствует пониманию методов консервации сердца.
Часто задаваемые вопросы
Практическая значимость для отрасли
Надежная оценка функции обоих желудочков сердца мыши ex vivo в модели Лангендорфа позволяет точно определить жизнеспособность сердца донора после холодного консервирования, что напрямую позволяет снизить риск развития первичной дисфункции трансплантата в исследованиях по трансплантации. Количественное измерение ответов левого и правого желудочков способствует механистическому снижению рисков и служит основой для раннего скрининга стратегий консервирования или потенциальных терапевтических препаратов. Данная платформа повышает прогностическую достоверность на доклиническом этапе, поддерживая продвижение портфеля проектов с учетом рисков в области трансплантации сердца.&D.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках&D
Первичный поиск и валидация мишени
- Позволяет исследовать механизмы повреждений, вызванных консервацией, в нативных клетках сердца.
- Обеспечивает функциональную валидацию мишеней для вмешательств, направленных на снижение дисфункции трансплантата.
- Способствует механистическому снижению рисков путем разграничения ответов на консервацию в левом и правом желудочках.
- Предоставляет надежную платформу для скрининга кардиопротекторных агентов на основе выдвинутых гипотез.
Скрининг и разработка анализа
- Обеспечивает стандартизированное и воспроизводимое измерение функции желудочков после консервации.
- Позволяет получать количественные показатели (dP/dt, зависимости «давление-объем») для сравнительного анализа.
- Обеспечивает возможность масштабируемого скрининга протоколов консервации и потенциальных соединений на трансгенных моделях мышей.
- Поддерживает готовность анализа для последующей валидации в рабочих процессах трансплантации.
Трансляционные и доклинические исследования
- Соответствует релевантным моделям заболевания при первичной дисфункции трансплантата для обеспечения трансляционной преемственности.
- Связывает результаты этапа поиска (discovery) с доклинической валидацией с использованием функциональных конечных точек сердечной деятельности.
- Служит основой для обоснованного с учетом рисков продвижения стратегий консервации и терапевтических кандидатов.
- Поддерживает разработку биомаркеров путем корреляции функциональных показателей с молекулярными сигнатурами.
Интеграция конвейеров и рабочих процессов
Эта модель Лангендорфа ex vivo позволяет оценивать сохранность сердца на стыке этапов первичных исследований, идентификации перспективных соединений и доклинической валидации в области трансплантологии.
- Биологические исследования: позволяют проверять гипотезы о механизмах повреждения при консервации и функциональных результатах.
- Скрининг: обеспечивает воспроизводимые количественные данные о функции желудочков для оценки протоколов и соединений.
- Аналитика: поддерживает статистическое сравнение продолжительности консервации и эффектов лечения с использованием показателей dP/dt и давления.
- Трансляционные исследования: облегчают переход от изучения механизмов к доклиническим моделям трансплантации.
- Корпоративное повторное использование: предоставляет многократно используемую платформу для итерационного скрининга и валидации на различных генетических фонах.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: повышает точность прогнозирования стратегий консервации и валидации мишеней для функционирования трансплантата.
- Операционная ценность: стандартизирует функциональную оценку, обеспечивая воспроизводимость и масштабируемость доклинических исследований.
- Стратегическая ценность: улучшает процесс принятия решений о целесообразности («go/no-go») применения потенциальных методов вмешательства, снижая биологические риски на поздних стадиях.
- Влияние на портфель: поддерживает приоритизацию протоколов консервации и терапевтических кандидатов с учетом рисков.
Рекомендации по внедрению
- Требуется опыт в области изоляции сердца мышей и методов эксвиво-перфузии.
- Необходимы точные приборы для измерения давления и сбора данных.
- Требуется стандартизация протоколов консервации и перфузии между исследовательскими группами.
- Метод может быть адаптирован для различных трансгенных моделей мышей при проведении механистических исследований.
- Надежность данных зависит от стабильного качества перфузии и калибровки оборудования.
