Собственное устройство фотодинамической терапии на основе светодиодов для повышения цитотоксичности вертепорфина в 2D-модели клеточной культуры

Фотодинамическая терапия, ФДТ, предлагает несколько преимуществ для лечения рака, и ее эффективность зависит от источника света для активации фотосенсибилизатора. Несмотря на недавние достижения в этой области, существует отсутствие доступа к дорогому и воспроизводимому устройству для PTD для моделей in vitro. Чтобы удовлетворить этот спрос, в этой работе описывается новое, простое и недорогое устройство для выполнения анализов PDT на клеточных культурах под названием PhotoAct.

Чтобы начать строительство, распилили три миллиметра толщиной древесноволокнистые плиты средней плотности, МДФ, чтобы получить куски со следующими размерами. Постройте два блока со следующими размерами. Просверлите заднюю часть большого ящика, чтобы установить разъем для разъема ствола.

Также просверлите верхнюю часть большей коробки, верхнюю и нижнюю части меньшей коробки, чтобы обеспечить проход для электрических кабелей. Покрасьте все внутренние поверхности черными чернилами, чтобы способствовать однородному освещению. Параллельно прикрепите три светодиодные ленты с 10 светодиодами каждая на верхней внутренней поверхности меньшей коробки.

Кроме того, установите датчик яркости в центре нижней внутренней поверхности меньшей коробки. Распечатайте структуру блока управления с помощью дополнительного файла 3D-печати. Установите все компоненты, кнопку питания, потенциометры, сенсорную панель времени запуска, светодиоды, датчик яркости, ЖК-дисплей, зуммер и блок питания, а также части платы контроллера ESP-32, установленные внутри блока управления.

Загрузите программный код, доступный в дополнительном файле, и запустите тест, чтобы убедиться, что все подключения работают. Соберите коробки и закрепите их вместе, чтобы избежать зазоров и, следовательно, внешних помех освещения и немедленной потери света. Прикрепите установленный блок управления к просверленной области в верхней части прототипа.

Соорудите входную дверь из того же материала в следующих размерах, и закрепите ее на внешней коробке петлями и Velcro лентами, чтобы обеспечить закрытие камеры и непрерывные анализы. Также установите ручку для управления входной дверью с легкостью и точностью. Прикрепите четыре резиновые ножки в нижней части прототипа, чтобы обеспечить большую стабильность во время операций.

Культивируйте клеточную линию HeLa в модифицированном Eagle Medium от Dulbecco с низким содержанием глюкозы с 10% фетальной бычьей сыворотки и 1% гентамицина. Держите колбы для культуры при 5% углекислого газа и 37 градусах Цельсия. Управляйте и осматривайте культуру клеток до достижения 80-90% слияния.

Запустите протокол жизнеспособности клеток с процесса посева. Удалите среду из колбы со сливающейся культурой клеток HeLa. Промыть колбу фосфатным буферным физиологическим раствором PBS и отделить культуру трипсином, следуя выделенным деталям.

Подсчитайте повторно суспендированные клетки с помощью гемоцитометра и посейте их в многолуночную микропластину в концентрации 20 000 клеток на лунку. Подготовьте две пластины для темных и светлых условий лечения и инкубируйте их в течение 24 часов для прикрепления клеток. Чтобы приступить к лечению фотосенсибилизатором, удалите среду с обеих пластин и обработайте клетки 100 микролитрами возрастающих концентраций вертепорфина.

Держите клетки в лечении в течение 24 часов, чтобы обеспечить интернализацию вертепорфина. После инкубации снимают обработку, промывают клетки PBS и добавляют безмедикаментозную среду. Накройте одну микропластинку алюминиевой фольгой, чтобы защитить ее от воздействия света, и инкубируйте ее в течение 24 часов.

Эта микропластина предложит контрольные данные для дальнейшего анализа результатов PDT. Другая микропластинка будет использоваться при освещении в PhotoAct. Для работы оборудования подключите его к розетке и включите, нажав кнопку питания.

Поместите многолуночную микропластину в камеру PDT и закройте оборудование, скрепив фронтальную дверь боковыми Velcro лентами. Чтобы настроить оборудование, используйте потенциометры для настройки RGB-конфигурации светового излучения. Нажмите клавишу плюс/минус тачпад, чтобы настроить конфигурацию времени и установить продолжительность анализа.

Проверьте, отображается ли на дисплее правильная информация об анализе, и при необходимости внесите окончательные коррективы. Нажмите начальную сенсорную панель, чтобы начать анализ. В начале эксперимента должен быть слышен зуммер с одним звуковым сигналом.

Во время эксперимента на дисплее можно наблюдать информацию о прогрессе, такую как излучение и оставшееся время. Не открывайте входную дверь и не изменяйте конфигурацию во время анализа PDT. В конце анализа должен быть слышен зуммер с четырьмя звуковыми сигналами, и электронная система выключит все светодиоды.

Готовое сообщение и конечное количество энергии, развернутой во время эксперимента, можно наблюдать на дисплее. Конечное значение флюенса вычисляется по выделенному уравнению. Накройте микропластинку, которая подверглась воздействию света, и приступайте к 24-часовой инкубации.

После инкубационного периода удаляют среду с обеих пластин, промывают монослой клеток ПБС, добавляют раствор МТТ. Инкубируйте обе пластины в темных и светлых условиях в течение четырех часов, чтобы обеспечить образование кристаллов формамазана. Осторожно удалите раствор МТТ и растворите фиолетовые кристаллы раствором ДМСО и этанола.

После полного растворения кристаллов проводят измерение поглощения с помощью микропластичного считывателя на 595 нанометров. Конечный продукт состоит из темной камеры с верхней внутренней поверхностью, оснащенной набором из 30 рассеянных светодиодов, светодиодов, запрограммированных на излучание различных спектров видимого света. Однородное падение света устанавливается за счет низкой отражательной способности внутренних поверхностей и равномерного распределения конфигурации светодиодов.

Интерфейс настройки удобен для пользователя, а установленное экспериментальное состояние было воспроизводимым. В качестве доказательства концепции устройство использовалось для усиления цитотоксического эффекта вертепорфина в культуре клеток 2D HeLa после воздействия света. Как показано на рисунке, значение GI50 составляло 3,1 микромоляра для состояния освещенности.

и 13,8 микромолярия для темного состояния Таким образом, увеличение эффективности более чем в четыре раза при сравнении условий подтверждает использование Вертепорфина в качестве фотосенсибилизатора и применимость PhotoAct на анализах PDT. Чтобы подтвердить использование прототипа, описанного в этой работе, коммерческое устройство PDT использовалось в тех же экспериментальных условиях, включая фотосенсибилизатор, клетки и флюенс, и результаты сравнивались. Как показано на рисунке, оба устройства фотоактивировали Вертепорфин в равной степени, усиливая цитотоксический эффект.

Наконец, ROS-опосредованная гибель клеток, вызванная Вертепорфином после воздействия света, была подтверждена проточной цитометрией с использованием анализа DCFDA. Таким образом, устройство было легко построено с коммерчески доступными недорогими компонентами с общей стоимостью менее 50. Основными другими преимуществами устройства являются портативность, низкая потребность в обслуживании, способность облучать несколько типов культуральных пластин, одновременное использование до четырех единиц на анализ, точное и воспроизводимое облучение, удобный и простой интерфейс настройки, который не требует подключения к компьютерам или другим машинам.

Кроме того, представлена блок-схема принятия решений, обеспечивающая систематический подход к решению проблем для поиска и исправления проблем или ошибок во время операции. Эти результаты позволяют расширить преимущества PhotoAct для облегчения ФДТ для научных исследований, изучения механизма действия фотосенсибилизаторов и их клинического применения.