Доклиническое тестирование лекарств в масштабируемых 3D-инженерных мышечных тканях

Наша платформа использует 3D-инженерные мышечные ткани и магнитное сенсорное оборудование для одновременного измерения сократительной способности в 24 лунках. Это обеспечивает более высокопроизводительный метод оценки новых терапевтических средств in vitro с использованием мышечных тканей человека. Наш метод литья улучшает консистенцию и воспроизводимость при изготовлении 3D-инженерных мышечных тканей.

Мы разработали расходную 24-луночную литейную пластину, оснащенную магнитным чувствительным оборудованием для измерения и анализа сократимости на нашей платформе. Этот метод может дать ценную информацию о моделировании заболеваний in vitro, открытии лекарств и генной терапии для любого мышечного заболевания, которое влияет на сократительную способность. В настоящее время мы включаем двигательные нейроны в наши 3D-конструкции, чтобы создать модель нервно-мышечного соединения.

Для начала поместите предварительно охлажденный набор для отливки тканей на холодный блок или лед внутри колпака для клеточной культуры. Положите литейную пластину плашмя на лед. Добавьте тромбин в базовую среду, чтобы получить раствор тромбина, и переместите пострешетку с литейной пластины на новую стерильную 24-луночную пластину.

Налейте пипеткой 50 микролитров раствора тромбина в каждую предварительно охлажденную лунку литейной пластины и поместите решетку обратно на набор. Отложите кастинговый набор на лед. Затем добавьте 500 миллилитров среды RPMI, 10 миллилитров B27 и 2,5 грамма аминокапроновой кислоты или ACA, чтобы приготовить сердечную среду EMT.

Выньте среду EMT, которая будет использоваться для отливки тканей, и добавьте в нее 10 микромолярных ингибиторов ROCK. Подготовьте скелетную среду EMT, добавив 50 миллилитров среды F10 и 0,25 грамма аминокапроновой кислоты или ACA для первичных миобластов. Используйте 0,1 грамма ACA для миобластов, полученных из IPSC.

Затем стерильно фильтруют литейную среду, содержащую ACA. Нагрейте реагент для диссоциации клеточной культуры и равный объем среды EMT до 37 градусов Цельсия. Эта нагретая среда EMT будет использоваться для разбавления реагента диссоциации.

Промойте клетки PBS и добавьте подогретый реагент диссоциации, чтобы поднять клетки. Инкубируйте при температуре 37 градусов по Цельсию в течение пяти минут или до тех пор, пока клетки не поднимутся, и проверяйте культуры каждые две-три минуты, постукивая по стенке тарелки. Как только клетки поднимутся, перенесите их в коническую трубку объемом 50 миллилитров.

Тритурат с помощью пипетки P-1000 для обеспечения одноклеточной суспензии. Промойте тарелку и колбу дополнительной средой EMT, чтобы собрать оставшиеся клетки и добавить их в коническую трубку. Опять же, тритуируйте клетки, чтобы обеспечить одноклеточную суспензию.

Добавьте среду EMT, чтобы остановить процесс диссоциации, а затем возьмите образцы клеточных суспензий для подсчета клеток. Выполняйте подсчет клеток с помощью автоматического счетчика клеток или гемоцитометра трипанового синего цвета. Вращайте клетки при 200 г в течение четырех минут, аспирируйте надосадочную жидкость и повторно суспендируйте клетки в пяти миллилитрах базовой среды EMT, чтобы удалить остаточный реагент диссоциации.

После повторного центрифугирования в течение четырех минут аспирируйте надосадочную жидкость и приготовьте клеточные суспензии с соответствующей плотностью. Рассчитайте объемы каждого клеточного раствора, необходимые для составления нужного количества тканей, и нанесите рассчитанные объемы клеток пипеткой в коническую трубку объемом 15 миллилитров. Добавьте 10 микролитров фибриногена на ЕМТ в клеточную суспензию и поместите ее на лед.

Убедитесь, что каждая ЕМТ имеет 90 микролитров клеточной суспензии, 10 микролитров фибриногена и 50 микролитров раствора тромбина в окончательной тканевой конструкции. В колпаке для культивирования клеток снимите крышку набора для литья тканей и поместите литейную пластину с решеткой, лежащей плашмя на льду. Смешайте клеточную смесь фибриногена и наберите 100 микролитров пипеткой Р-200.

Добавьте 100 микролитров смеси в лунки, приготовленные с 50 микролитрами раствора тромбина, и тритурируйте пять раз, чтобы хорошо перемешать. Не проталкивайте пипетку дальше первой упора и не снимайте наконечник после растирания, чтобы избежать образования пузырьков. Смешайте клеточную суспензию в конической трубке перед отливкой каждой ткани.

Держите решетку и пластину для литья одновременно указательным и большим пальцами одной руки, чтобы избежать движения решетки, или оставьте пластину плоской на льду и качните ведро со льдом, чтобы заглянуть в литейную пластину. Повторите то же самое со свежим наконечником P-200 для каждой ткани, пока все ткани не будут отлиты. Аккуратно перенесите семенной набор в инкубатор и выдерживайте при 37 градусах Цельсия в течение 80 минут.

Затем подготовьте свежую 24-луночную пластину с двумя миллилитрами на лунку среды EMT для сердечных тканей и инкубируйте пластину при 37 градусах Цельсия, чтобы нагреть среду. После 80-минутной инкубации аккуратно добавьте один миллилитр среды EMT к краю заливных лунок и выдерживайте еще 10 минут при температуре 37 градусов Цельсия. Через 10 минут инкубации осторожно приподнимите столбовую решетку и перенесите ткани из литейной пластины в подготовленную 24-луночную пластину с подогретой средой.

Наконец, верните пластины с тканями в инкубатор клеточных культур при температуре 37 градусов Цельсия. Неудачное производство ЕМТ может варьироваться от катастрофических отказов, таких как отслоение тканей от столбов, до более тонких структурных дефектов, таких как пузырьки воздуха и неравномерное осаждение тканей вокруг обоих постов. Конструкция EMT через день после отливки показана здесь.

Ткани скелетных мышц переносили в среду дифференцировки, начиная с нулевого дня слияния клеток и гидрогелевого уплотнения. С седьмого по 28-й день одна и та же ЕМТ показала немного меньшую общую длину между двумя стойками и меньшую ширину при измерении через среднюю часть ЕМТ. Четыре пластины тканей отслеживались в течение 21 дня, сравнивая диаметр ЕМТ во время уплотнения.

Временные точки показывают постоянный размер ЕМТ между пластинами. Максимальное уплотнение достигается на 21-й день, когда происходит стабилизация ремоделирования матрицы. Здесь изображена иммуногистохимия ЕМТ.

ЕМТ фиксировали на 10-й день посева и вводили в парафин. Тонкие поперечные срезы окрашивали антителами против миозина, тяжелой цепи и дистрофина перед визуализацией. Эти графические изображения представляют собой среднюю абсолютную силу подергивания, измеренную сердечными и скелетными ЕМТ с течением времени.

Здесь показано лечение острым и хроническим доксорубицином в искусственно сконструированных тканях сердца. Три различные концентрации дозы Dox доставлялись либо болюсно, либо непрерывно вводились в искусственные ткани сердца в течение 27 дней. Доза-реакция на BDM в сконструированных тканях скелетных мышц представлена на этом рисунке.

Частота сердечных сокращений или частота подергивания прекращаются дозозависимым образом в тандеме с прекращением сократительной силы, что указывает на кардиотоксичность при воздействии этого соединения на ЕМТ. Самое важное, что нужно помнить при отливке тканей, - это всегда держать все холодным, включая клеточную суспензию и реагенты, а также держать пострешетку полностью неподвижной после начала отливки.