Стерилизация низкими дозами гамма-излучения для децеллюляризированных трансплантатов трахеи

Этот протокол обеспечивает полный процесс стерилизации любого нестерильного органа, не влияя на его характеристики. Основной задачей данной методики является возможность стерилизации органа без ущерба для его свойств. Хотя этот метод был сосредоточен на трахеях, он продемонстрировал, что более низкие дозы гамма-излучения могут эффективно стерилизовать биологические материалы.

Человек может столкнуться с проблемой, определив самую низкую эффективную дозу для различных типов органов. Затем рекомендуется начать с более низкой дозировки и увеличивать ее до тех пор, пока не будет достигнута стерилизация. Начните с разделения трахеи, рассеченной у усыпленных новозеландских белых кроликов, или Oryctolagus cuniculus, на двухсантиметровые кусочки.

С помощью ножниц удалите окружающую соединительную ткань и внутренний слой слизистой оболочки. Погрузите образцы в 12 миллилитров раствора PBS, содержащего SDS, 5% пенициллина стрептомицина и 5% амфотерицина. Подвергайте трахеи постоянному перемешиванию магнитной мешалкой при 400 об/мин в течение пяти недель при комнатной температуре.

Еженедельно давайте два часа осмотического шока, погружая трахеи в дистиллированную воду перед сменой среды. Через пять недель криогенизируйте образцы трахеи, используя 12-миллилитровую смесь 80% FBS и 20% DMSO в контейнере для замораживания при температуре минус 80 градусов по Цельсию. Через 13-15 дней разморозьте трахеи на водяной бане при температуре 37 градусов Цельсия.

Затем вымойте их с помощью PBS. Чтобы облучить образец, поместите четыре кусочка трахеи в 20 миллилитров PBS в колбы для культуры метакрилата T25, предотвращая при этом образование пузырьков. Проводят облучение с помощью линейного ускорителя с фотонами номинальной энергии 10 мегавольт, сплющивая бесфильтрующие пучки.

Применяют мощность дозы 2 400 единиц монитора в минуту и устанавливают другие параметры, как описано в рукописи. После этого культивируйте образец в 30 миллилитрах DMEM с добавлением 10% инактивированного FBS без антибиотиков или противогрибковых препаратов. Инкубируйте культуру в стандартном тканевом инкубаторе при температуре 37 градусов Цельсия и 5% углекислого газа в течение двух недель и проверяйте ее каждые 24 часа на наличие параметров загрязнения, таких как pH среды, цвет и изменения мутности.

Проводите испытания на растяжение на настольной универсальной испытательной машине или контроле перемещения UTM, оснащенной датчиками силы и положения, а также компьютером со специально разработанным программным обеспечением. Записывайте данные каждые 0,4 секунды и экспортируйте их в электронную таблицу. Сконструируйте растягивающие челюсти, адаптированные к среднему калибру трахеи кролика, из чистого монослойного нетоксичного кристаллического поливинилхлорида или полых трубок из ПВХ.

Разрежьте провода на трехсантиметровые сегменты. Чтобы выполнить терминально-терминальный шов без смещения, просверлите 12 предварительно сформированных отверстий в двух миллиметрах от края челюстей, разделенных 2,5 миллиметрами. Затем прикрепите стеклянные трубки из ПВХ к трахее кролика с помощью терминально-терминального анастомоза с непрерывным нейлоновым монофиламентным швом 6-0 через поочередно выполняемые пятимиллиметровые отверстия на расстоянии двух миллиметров от края трахеи.

Растягивайте все детали со скоростью смещения 5,0 миллиметров в минуту. Затем запишите переменные, такие как максимальное напряжение и деформация, энергия, запасенная на единицу объема трахеи, и модуль Юнга. Выполняйте испытания на радиальное сжатие на настольном компрессионном UTM, оснащенном тензодатчиком на 15 ньютонов, для получения данных о силе, положении и времени.

Записывайте данные и экспортируйте их в электронные таблицы с интервалом в 0,5 секунды. Поместите трахеи так, чтобы перепончатая область опиралась на нижнюю пластину до постепенного подъема пластины к верхней пластине с постоянной скоростью пять миллиметров в минуту. Рассчитайте каждую переменную на единицу длины образца, жесткость и энергию на единицу площади поверхности, необходимую для полной закупорки трахеи.

Установите стерильный внутрипросветный стент из ПВХ размера 14, обеспечив трех-четырехмиллиметровый край на каждом конце. Зафиксируйте стент одним нейлоновым монофиламентным швом 6-0 через межхрящевое пространство первого хряща. В асептических условиях и со стерильным материалом делают продольный трехсантиметровый центральный разрез грудной клетки и собирают двусторонние лоскуты на ножках, состоящие из грудной фасции и мышечного компонента.

Оберните трахеи лоскутом у четырех кроликов, по одной трахее на каждом гематораксе. После завершения операции отмените анестезию, прервав введение изофлурана. Из восьми частей, подвергшихся воздействию 0,5 килогрей радиации, две части показали изменение цвета среды в течение одной недели.

Тем не менее, ни один из фрагментов, которые были облучены на один или два килогрея, не показал каких-либо изменений в цвете носителя. По сравнению с контролем, в анализируемых образцах, облученных при разных дозах облучения, не было выявлено изменений характера распределения коллагена или эластичных волокон. Данные, полученные при испытании на растяжение на облученных трахеях, приведены здесь.

Кривые напряженной деформации для децеллюляризированных и облученных трахей не выявили изменений по сравнению с нестерилизованными трахеями. Показаны компрессионные тесты, выполненные на нативных трахеях или контрольной группе, а также на децеллюляризированных, криоконсервированных и облученных трахеях. Соответствующие графики показали, что облучение не изменяло процент окклюзии по сравнению с нативной трахеей.

Гамма-облучение вызывало клинически минимальное, но статистически значимое снижение радиобиомеханических характеристик и переменной силы на единицу длины. Гистологическое исследование показало высокоорганизованную соединительную ткань в виде надхрящницы нативной трахеи. Хрящ был цел и не имел признаков некроза.

При имплантации радиологического элемента живому существу стерильность имплантата и стерильный процесс имеют первостепенное значение, чтобы избежать инфицирования и отторжения тканей. Существует широкий спектр органов, которые должны быть имплантированы после создания ткани, и они должны быть стерильными. Следуя этому процессу, можно добиться полной стерилизации, не влияя на основные характеристики органа.