Многофотонная лазерная абляция центров организации цитоплазматических микротрубочек в мышиных ооцитах
11 ноября 2022 г.
Представлен оптимизированный протокол, позволяющий истощать центры организации цитоплазматических микротрубочек в ооцитах мыши во время метафазы I с использованием фемтосекундного лазера ближнего инфракрасного диапазона.
Этот протокол предлагает отличную стратегию селективной абляции цитоплазматических MTOC, которые являются критически важными регуляторами для позиционирования веретена в ооцитах мыши. Таким образом, это способствует нашему пониманию молекулярных механизмов, регулирующих мейоз ооцитов. Данная методика позволяет проводить таргетную абляцию в живых ооцитах с высокой пространственной точностью и с минимальным фототоксическим воздействием на клетку. Этот протокол может быть использован для индуцирования селективного механического возмущения различных инструкторов без изменения жизнеспособности клеток. Этот протокол требует технических навыков для абляции всех цитоплазматических MTOC в кратчайшие сроки, чтобы избежать нарушения жизнеспособности ооцитов. Поэтому очень важно отработать эту технику несколько раз перед проведением фактического эксперимента. Для начала дополните среду CZB глютамином и милриноном и поместите ее в инкубатор. Готовьте коллекцию и культуру блюд. Внесите четыре микрокапли коллекционной среды и две микрокапли питательной среды в чашки Петри 60 и 35 мм соответственно. И залейте их минеральным маслом. Держите чашку для сбора на подогревателе и инкубируйте при 37
Обзор
В данном протоколе представлена стратегия селективной абляции цитоплазматических центров организации микротрубочек (ЦОМТ) в ооцитах мыши во время метафазы I с использованием ближнего инфракрасного фемтосекундного лазера. Этот метод расширяет наше понимание молекулярных механизмов, регулирующих мейоз ооцитов, при одновременном сведении к минимуму фототоксического воздействия на клетки.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Нейробиология
- Клеточная биология
- Биология репродукции
Теоретическая часть
- Цитоплазматические центры организации микротрубочек (ЦОМТ) имеют решающее значение для позиционирования веретена деления в ооцитах.
- Понимание их роли может дать представление о мейозе ооцитов.
- Методы направленной абляции позволяют изучать клеточные механизмы.
- Минимизация снижения жизнеспособности клеток имеет важное значение в таких экспериментах.
Цель исследования
- Разработать протокол для селективной абляции цитоплазматических МЦО.
- Исследовать влияние истощения МЦО на мейоз ооцитов.
- Усовершенствовать методы обеспечения высокой пространственной точности в экспериментах на живых клетках.
Используемые методы
- Ближний инфракрасный фемтосекундный лазер для направленной абляции.
- Приготовление среды CZB с добавлением глутамина и милринона.
- Использование чашек для сбора и культивирования при работе с ооцитами.
- Условия инкубации при температуре 37°C.
Основные результаты
- Успешная абляция цитоплазматических MTOC с минимальной фототоксичностью.
- Сохранение жизнеспособности ооцитов после абляции.
- Углубление понимания механизмов позиционирования веретена деления.
- Протокол продемонстрировал высокую пространственную точность в живых ооцитах.
Выводы
- Данный протокол эффективно истощает цитоплазматические центры организации микротрубочек (ЦОМТ) в ооцитах мыши.
- Он представляет собой ценный инструмент для изучения мейоза ооцитов.
- Дальнейшее применение метода может быть направлено на исследование различных клеточных механизмов.
Часто задаваемые вопросы
Практическая значимость для отрасли
Точное манипулирование цитоплазматическими центрами организации микротрубочек (ЦОМТ) в ооцитах мыши позволяет целенаправленно исследовать механизмы позиционирования веретена деления, которые являются критически важными факторами точности мейоза и способности к дальнейшему развитию. Данная возможность способствует механистическому снижению рисков на самых ранних этапах репродуктивной биологии, обеспечивая валидацию мишеней и прогностическую достоверность трансляционных исследований. Интеграция селективной многофотонной лазерной абляции расширяет имеющийся инструментарий, позволяя проводить функциональные исследования субклеточных структур без нарушения жизнеспособности клеток.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Первичное открытие и валидация мишени
- Позволяет напрямую проверить роль цитоплазматических MTOC в позиционировании веретена деления и мейозе ооцитов.
- Обеспечивает механистическую проверку гипотез за счет изоляции вклада конкретных субклеточных структур.
- Способствует функциональной валидации мишеней для путей, регулирующих сегрегацию хромосом.
Скрининг и разработка анализа
- Предоставляет валидированную систему для воздействия на динамику миграции веретена деления в живых ооцитах и ее количественной оценки.
- Обеспечивает воспроизводимую высокоточную абляцию с минимальной фототоксичностью, что способствует стандартизации анализа.
- Позволяет подготовить ооциты для последующего количественного анализа положения веретена деления и результатов его миграции.
Трансляционные и доклинические исследования
- Соответствует моделям анеуплоидии и мейотических ошибок в ооцитах млекопитающих, имеющим значение для патологии.
- Обеспечивает преемственность от механистических открытий до доклинической валидации регуляторов сборки веретена деления.
- Позволяет осуществлять с учетом рисков продвижение мишеней, вовлеченных в репродуктивное здоровье и биологию развития.
Интеграция конвейеров и рабочих процессов
Данный метод селективной абляции находится на стыке ранних этапов открытий и разработки доклинических моделей, позволяя проводить исследование механизмов позиционирования веретена деления в живых ооцитах на основе выдвинутых гипотез.
- Фундаментальная биология: позволяет проверить нулевую гипотезу о функциональной роли цитоплазматических MTOC в миграции веретена деления.
- Скрининг: обеспечивает воспроизводимые количественные данные по фенотипам позиционирования и миграции веретена деления.
- Аналитика: позволяет проводить статистическое сравнение динамики веретена деления в аблированных и контрольных ооцитах.
- Трансляционные исследования: дает понимание механизмов, имеющих значение для доклинических моделей ошибок сегрегации хромосом.
- Прикладное использование: создает воспроизводимую платформу для направленного субклеточного воздействия в системах живых клеток.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: Повышает достоверность прогнозов при валидации мишеней и снижает неопределенность механизмов в путях сборки веретена деления.
- Практическая ценность: Стандартизирует абляцию живых клеток с высокой пространственной точностью и минимальной потерей жизнеспособности клеток.
- Стратегическая ценность: Оптимизирует принятие решений о целесообразности дальнейшей разработки мишеней, влияющих на точность мейоза и репродуктивный потенциал.
- Влияние на портфель: Позволяет проводить приоритезацию мишеней в области репродуктивной биологии для дальнейшей разработки с учетом рисков.
Особенности реализации
- Требуется технический опыт в области многофотонной лазерной абляции и визуализации живых клеток.
- Необходимы специализированные приборы для высокоточного наведения и обеспечения минимальной фототоксичности.
- Требуется стандартизация протоколов абляции и оценки жизнеспособности между исследовательскими группами.
- Может потребоваться адаптация метода для различных моделей ооцитов или субклеточных мишеней.
- Для предотвращения нарушения жизнеспособности ооцитов в процессе абляции необходима практика и высокая степень профессионального навыка.
Часто задаваемые вопросы о биофармацевтике
Chapters in this video
0:05
Introduction
1:12
Mouse Oocyte Collection
2:53
Oocyte Microinjection
4:16
Oocyte Maturation
5:02
Microscope Preparation for Ablation
6:05
Ablation of Metaphase Cytoplasmic Microtubule Organizing Centers (mcMTOCs)
6:59
Results: Depletion of Metaphase Cytoplasmic Microtubule Organizing Centers in Mouse Oocytes
7:35
Conclusion
