Эффективный клиринговый протокол для изучения развития семян в томатах (Solanum lycopersicum L.)
7 сентября 2022 г.
Семена томатов являются важной моделью для изучения генетики и биологии развития во время размножения растений. Этот протокол полезен для очистки семян томатов на разных стадиях развития, чтобы наблюдать более тонкую эмбриональную структуру.
Этот метод может помочь исследователям быстро и без усилий найти аномальные периоды развития эмбриона томата. Основным преимуществом данного протокола является обработка семян томатов гипохлоритом натрия, который обеспечивает основу для наблюдения за эмбрионами томатов. Начните с химической подготовки и сбора плодов Solanum lycopersicum через три-23 дня после цветения или DAF.
Сразу же выложить плоды на лед и разделить их на ранние, средние и поздние плоды, исходя из дней после цветения. Разбейте ранний плод, положите его на горку и тщательно соберите свежие семена с помощью точных щипцов под 1-4-кратным увеличением стереомикроскопа. Для средних и поздних плодов разбейте плоды и непосредственно соберите свежие семена с помощью прецизионных щипцов.
В обычном методе переложите свежесобранные семена немедленно в двухмиллилитровую центрифужную трубку, содержащую фиксатор FAA 1,5 миллилитра, и поместите трубку на орбитальный шейкер при 5 оборотах в минуту в течение четырех часов при комнатной температуре. Затем обезвоживают семена в 70% 95% и 100% этаноле в течение одного часа каждый на орбитальном шейкере со скоростью 5 оборотов в минуту. После этого поместите семя в три-пять капель очищающего раствора, присутствующего на слайде, и аккуратно накройте его крышкой.
Используйте один вогнутый слайд для средних и поздних семян. В зависимости от стадий развития семян, инкубируйте их при комнатной температуре для очистки. После инкубации наблюдают образцы с дифференциальным интерференционным контрастом или ОВС-микроскопом, оснащенным цифровой камерой с 10-кратным, 20-кратным и 40-кратным увеличением.
Отрегулируйте и оптимизируйте яркость пропускаемого света, ползунок DIC и диафрагму конденсатора в режиме реального времени для каждого образца и захват изображений. Переложите свежие семена, собранные из разбитых плодов, в двухмиллилитровую центрифужную трубку, содержащую 1,5 миллилитра дезинфицирующего раствора. Инкубируйте образцы на орбитальном шейкере при 30 оборотах в минуту в течение трех-50 минут при комнатной температуре.
Как только будет хорошо виден самый внутренний контур оболочки семян, отбросьте дезинфицирующий раствор. Для средних и поздних семян перенесите семена на горку. Используйте щипцы и рассекающую иглу для удаления семенной слизи под 1-4-кратным увеличением стереомикроскопа.
Перенесите семена обратно в исходную центрифужную трубку с помощью щипцов. Вымойте их пять раз в 1,5 миллилитрах деионизированной воды в течение 10 секунд каждый и выбросьте деионизированную воду. Далее добавьте к семенам двойной объем очищающего раствора.
В зависимости от стадии семени, давайте прерывистую вакуумную обработку в течение от нуля до 50 минут, с интервалом в 10 минут после каждой вакуумной обработки 10 минут. После вакуумной обработки замените очищающий раствор. Чтобы облегчить очистку семян, поместите центрифужную трубку защищенной от света на 30 минут до семи дней при комнатной температуре.
В случае поздних эмбрионов ежедневно заменяйте раствор свежим очищающим раствором, после чего подвергайте семена вакуумной обработке в течение 10 минут. Поместите очищенные семена на горку или один вогнутый слайд. Используя микроскоп DIC, оснащенный цифровой камерой, регулируйте и оптимизируйте яркость пропускаемого света, ползунок DIC и диафрагму конденсатора в режиме реального времени для каждого образца и захватывайте изображение.
При традиционном методе очистки семян S.lycopersicum плотные клетки эндосперма блокировали визуализацию ранних эмбрионов при 3 и 6 DAF. Снижение проницаемости во время роста семян приводило к нечетким изображениям после 9 DAF. Слизь семян и оболочка семян постепенно становились плотнее, предотвращая проникновение очищающих агентов от 13 DAF и далее.
Контур эмбриона внутри 14-19 семян DAF был чрезвычайно размытым, несмотря на увеличенное время обработки в семь дней. Внутренняя структура в 22 семенах DAF была совершенно невидимой. Зачищенная слизь семенной оболочки, полученная эпидермальными клетками семенной оболочки, была заметна начиная с 13 DAF и далее.
Обработка гипохлорита натрия позволила четко идентифицировать внутреннюю оболочку семян и отслоить большую часть адгезивной слизи без повреждения семян. В оптимизированном протоколе очистки семена показали удовлетворительную прозрачность на всех проверенных стадиях развития. Наблюдались отчетливые клеточные слои семенной оболочки при 3 DAF, различимые клетки эндосперма при 5 DAF, палочковидный эмбрион при семи DAF, шаровидная стадия при 9 DAF и стадия сердца при 11 DAF.
В оптимизированном протоколе степень скручивания семядолий и стреляющей апикальной меристемы очень легко фиксировалась на различных стадиях эмбрионального развития. Стерилизация удаляет слизь семян и пигмент семенной оболочки, которые улучшают проникновение семян и визуализацию. Вакуумная обработка может ускорить проникновение очищающего раствора.
Просмотрите полный транскрипт и получите доступ к тысячам научных видео
Обзор
Семена томата служат важной моделью для исследования генетики и биологии развития при воспроизводстве растений. Данный протокол позволяет проводить просветление семян томата на различных стадиях развития для изучения сложной структуры зародыша.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Генетика
- Биология развития
- Размножение растений
Теоретические сведения
- Семена томата имеют важное значение для изучения эмбрионального развития растений.
- Понимание стадий развития зародыша томата позволяет получить важные генетические данные.
- Методы просветления улучшают визуализацию эмбриональных структур.
- Обработка гипохлоритом натрия является ключевым этапом для наблюдения за зародышем.
Цель исследования
- Предоставить протокол осветления семян томатов.
- Облегчить наблюдение за эмбрионами томатов на различных стадиях развития.
- Помочь исследователям в определении периодов аномального развития эмбрионов.
Используемые методы
- Сбор плодов Solanum lycopersicum через 3–23 дня после цветения.
- Разделение плодов на ранние, средние и поздние категории в зависимости от количества дней после цветения.
- Сбор свежих семян с помощью прецизионного пинцета под стереомикроскопом.
- Обработка семян гипохлоритом натрия для улучшения визуального наблюдения.
Основные результаты
- Данный протокол обеспечивает четкую визуализацию зародышей томата.
- Исследователи могут эффективно выявлять нарушения развития.
- Можно отчетливо наблюдать различные стадии развития зародыша.
- Метод является простым и эффективным для изучения эмбриогенеза.
Выводы
- Данный протокол является ценным инструментом для исследований в области биологии развития растений.
- Он расширяет понимание эмбриогенеза семян томата.
- Будущие исследования могут опираться на этот метод для изучения генетических вариаций.
Часто задаваемые вопросы
Практическая значимость для индустрии
Эффективная визуализация эмбриогенеза семян томата устраняет ключевое узкое место в биологии развития растений и поиске полезных признаков. Данный протокол просветления позволяет проводить количественную оценку стадий развития семян с высоким разрешением, что способствует проведению исследований на основе гипотез и генетическому скринингу в рамках программ по улучшению сельскохозяйственных культур. Улучшенная непрерывность визуализации на протяжении различных окон развития повышает прогностическую точность прикладных исследований и разработки в области растениеводства, а также при валидации признаков.
Стратегические приложения в биофармацевтических исследованиях и разработках
Первичный поиск и валидация мишени
- Обеспечивает точную морфологическую оценку стадий эмбрионального развития для валидации генетических мишеней.
- Способствует выявлению нарушений развития у мутантных линий для анализа сигнальных путей.
- Поддерживает биологическую минимизацию рисков путем уточнения контрольных точек развития при формировании семян.
Скрининг и разработка анализа
- Предлагает стандартизированный протокол подготовки просветленных семян, подходящих для количественного имиджингового анализа.
- Повышает воспроизводимость и масштабируемость при фенотипическом скрининге признаков семян.
- Обеспечивает надежное сравнение фенотипов развития различных генотипов и вариантов обработки.
Трансляционные и доклинические исследования
- Синхронизирует результаты визуализации развития с отбором трансляционных признаков в исследованиях и разработках сельскохозяйственных культур.
- Обеспечивает непрерывность процесса от генетических открытий до валидации в пребридинге для видов семейства Solanaceae.
- Снижает риск неудачи в реализации признака на поздних этапах за счет раннего выявления дефектов развития.
Интеграция в конвейер и рабочий процесс
Данный протокол интегрирован в цикл исследований и разработок по изучению признаков растений — от этапа открытия до валидации, начиная с раннего тестирования генетических гипотез и заканчивая фенотипическим скринингом и внедрением улучшенных признаков.
- Открывающая биология: способствует проверке гипотез и уточнению путей развития за счет обеспечения прямой визуализации эмбриональных структур.
- Скрининг: обеспечивает получение воспроизводимых просветленных семян, готовых к анализу, для количественного имиджинга и сравнения фенотипов.
- Аналитика: предоставляет морфологические данные высокого разрешения для статистического анализа хода развития.
- Трансляционные исследования: упрощают согласование признаков и продвижение с учетом рисков в программах по улучшению сельскохозяйственных культур.
- Корпоративное повторное использование: предлагает широко применимый рабочий процесс просветления для Solanaceae и родственных видов в портфелях исследований и разработок растений.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: Повышает достоверность прогнозирования при отборе признаков и валидации мишеней за счет устранения неопределенностей в процессе развития.
- Операционная ценность: Оптимизирует подготовку образцов, повышает воспроизводимость и снижает трудоемкость.
- Стратегическая ценность: Обеспечивает более обоснованное принятие решений о продолжении или прекращении разработки (go/no-go) и экономически эффективное продвижение признаков.
- Влияние на портфель: Поддерживает приоритезацию генетических линий и признаков развития с учетом рисков.
Особенности реализации
- Требуется опыт в области биологии развития растений и микроскопии.
- Необходим доступ к DIC-микроскопии и оборудованию для вакуумной обработки.
- Требуется стандартизация между исследовательскими группами для внедрения протокола и обеспечения сопоставимости данных.
- Метод может быть адаптирован для других видов семейства Solanaceae путем оптимизации протокола.
- Эффективность осветления может варьироваться в зависимости от толщины семенной кожуры и стадии развития.
Часто задаваемые вопросы по биофармацевтике
Chapters in this video
0:05
Introduction
0:30
Seed Collection
1:10
Chloral Hydrate-Based Clearing of Seeds Using a Conventional Protocol
2:21
Chloral Hydrate-Based Clearing of Seeds Using the Optimized Protocol
4:11
Results: Clearing Tomato (Solanum lycopersicum) Seeds at Different Developmental Stages to Observe the Finer Embryonic Structure
5:56
Conclusion
