Микроинженерные 3D-коллагеновые гидрогели с выравниванием волокон на большом расстоянии

Этот метод позволяет нам создавать 3D-коллагеновые гидрогели с контролируемыми уровнями выравнивания волокон для моделирования сред, обнаруженных в здоровых и больных тканях организма. Этот метод обеспечивает простой микрофлюидный подход к разработке выровненных коллагеновых гидрогелей, введению клеток и количественной оценке поведения клеток в топографически определенных 3D-средах. Продемонстрируют процедуру Нил Джоши, Мехран Мансури, Энн Байерли и Джастин Видас из моей лаборатории.

Для начала установите лист PDMS толщиной 250 микрометров на пластиковый носитель и вырежьте микрофлюидную конструкцию бритвой с помощью резака для рукоделия на глубине лезвия 0,5 миллиметра, скорости один сантиметр в секунду и высокой силе. С помощью ультразвуковой ванны очистите вырезы микрофлюидных каналов в течение пяти минут. Промойте ультразвуковые каналы в деионизированной воде и высушите их на горячей плите при температуре 100 градусов Цельсия в течение пяти минут.

Храните каналы в чистой, закрытой чашке Петри до использования. Чтобы изготовить покровный слой PDMS и функционализировать поверхность для будущей модификации, приготовьте 2%-ный раствор аминопропилтриэтоксисилана в стеклянном стакане, добавив один миллилитр аминопропилтриэтоксисилана к 49 миллилитрам ацетона. Затем разбавьте 25%-ный раствор глутарового альдегида до 5%-ного в деионизированной воде.

Сделайте два миллилитра раствора на каждые 24 миллиметра на 50 миллиметров покровного стекла. Очистите покровные листы в ультразвуковом аппарате для ванны в течение пяти минут с помощью IPA. Смойте IPA с покровных листов деионизированной водой.

Гладкая пленка воды на покровном листе свидетельствует о том, что IPA тщательно промыта. Высушите крышку на горячей плите в течение пяти минут при температуре 100 градусов Цельсия. Поместите высохшие накладки в чистые чашки Петри, следя за тем, чтобы они не перекрывались.

Используя трубку для коронного разряда, подвергайте покровные листы коронному разряду в течение одной минуты каждый. Снимите покровные листы в течение пяти минут после воздействия коронного разряда и погрузите каждый покровный лист в раствор аминопропилтриэтоксисилана на 10 секунд, убедившись, что покровное стекло погружено в воду. Затем извлеките покровные листы из раствора аминопропилтриэтоксисилана, погрузите их в ацетон на 10 секунд и высушите сжатым воздухом. Поместите сухую крышку обратно в чашку Петри обработанной стороной вверх.

Пипеткой нанесите один миллилитр раствора глутарового альдегида на поверхность каждого покровного стекла. Покройте как можно большую поверхность, не допуская, чтобы раствор вылился через край покровного стекла. Оставьте защитную крышку на раствор в течение 30 минут, а затем промойте деионизированной водой в течение 20 секунд.

Высушите покровные листы сжатым воздухом и поместите их обратно в чашки Петри плазменной обработкой стороной вверх. Для лазерной резки модульной магнитной основы вырежьте конструкции из слоя ПММА, используя соответствующие настройки лазера, такие как количество проходов и мощность. Настройки лазера должны быть отрегулированы таким образом, чтобы магниты можно было запрессовать в слое ПММА. Вымойте деталь, вырезанную лазером, водой с мылом, чтобы удалить мусор в процессе лазерной резки.

Не используйте растворители, так как они могут распространять микротрещины на краях, вырезанных лазером. Чтобы собрать платформу, вручную вставьте магниты в основание, вырезанное лазером. Толщина магнитов должна быть меньше толщины основания из ПММА, чтобы магниты находились на одном уровне с поверхностью основания.

Снимите подложку с чувствительного к давлению клея или листа PSA и прикрепите основание к покрытию, обработанному глутаровым альдегидом, функциональной стороной вверх. Аккуратно поместите вырез канала PDMS в полость, определенную рамой. Надавите пинцетом с широким наконечником, чтобы удалить пузырьки воздуха и обеспечить конформный контакт.

Поместите бычий сывороточный альбумин или крышку канала, обработанную BSA, поверх выреза канала стороной BSA вниз. Убедитесь, что впускные и выпускные отверстия для жидкости совмещены с каналом. Устройство готово к инъекции коллагена I.

Поместите шприцевой насос, охлажденный стерильный шприц, охлажденный нейтрализованный раствор коллагена I и стерильную иглу замка Люера 20-го калибра с углом наклона 90 градусов в шкаф биобезопасности. Загрузите раствор коллагена I в шприц, избегая пузырьков. Прикрепите наконечник иглы к шприцу, загрузите шприц в шприцевой насос иглой вниз и заправьте иглу раствором коллагена I.

Установите шприцевой насос на требуемую скорость потока от 50 до 2 000 микролитров в минуту. Поместите подготовленные каналы PDMS на лабораторный домкрат и выровняйте с иглой. Вставьте иглу во входное отверстие канала PDMS.

Вводите канал до тех пор, пока 30-литровая капля коллагена I не соберется на выходной стороне. Опустите лабораторный домкрат и аккуратно отделите иглу от только что заполненного канала. Повторяйте до тех пор, пока все каналы не будут заполнены раствором коллагена I.

Загрузите заполненные каналы в чашки Петри вместе с чистой безворсовой салфеткой, пропитанной деионизированной водой, чтобы предотвратить обезвоживание вновь образованного геля коллагена I. Накройте чашку Петри крышкой и поместите загруженные каналы в инкубатор на два часа до этапа отслаивания. Для отшелушивания и уравновешивания среды начните с снятия крышки PDMS с помощью пинцета, чтобы обнажить полимеризованный гель коллагена I.

Добавьте в лунку 650 микролитров эндотелиальных питательных сред. В качестве альтернативы можно прикрепить еще один модуль, чтобы ввести дополнительный слой коллагена или обеспечить возможности перфузии среды. Оставьте устройства в инкубаторе минимум на четыре часа, чтобы сбалансировать гель и среду.

Замените носитель перед посевом с ячейками. Функционализация стекла защитного стекла позволила снять канал, а функционализация покрытия PDMS с помощью BSA предотвратила прикрепление коллагена I. Выравнивание волокон коллагена I оставалось неизменным после снятия крышки.

Изображения HUVEC, культивируемых на выровненном сегменте матрицы, показали повышенное выравнивание актиновых волокон по сравнению с HUVEC на сегменте со случайными волокнами. Наш подход позволяет нам моделировать микроокружение опухоли и количественно оценивать, как реагируют различные типы клеток. Мы также можем внедрить проточные каналы для поддержки долгосрочных экспериментов.