Извлечение люмикана из амниотической мембраны и определение температуры ее хранения
14 октября 2022 г.
Настоящий протокол описывает извлечение люмиканов из амниотической мембраны (AM) и условия их хранения в виде экстракта AM (AME) при -20 °C, 4 °C и комнатной температуре (RT) в течение 6, 12, 20 и 32 дней для количественной оценки его белков и концентрации люмиканов.
Этот метод направлен на демонстрацию простой техники экстракции белка, полезной для получения обильных белков и других факторов. Этот метод может быть использован для извлечения других факторов и белков, присутствующих в амниотической мембране, а также для получения белков из других источников, таких как животные и растительные ткани. Начинают с размораживания 100 миллиграммов амниотической мембраны, полученной из банка амнионов.
После размораживания добавьте 10 миллилитров стерильного сбалансированного солевого раствора в чашку Петри и промойте мембрану в течение двух минут. Затем удалите использованный сбалансированный раствор соли в стакан и повторяйте процесс до тех пор, пока в чашке Петри не будет видно следов глицериновой среды. Затем добавьте 10 миллилитров диспазы II к мембране и инкубируйте при 37 градусах Цельсия и 5% углекислого газа в течение 30 минут.
В конце инкубации выполните механическую деэпителизацию с помощью резинового скребка для клеток полицейского. Затем визуализируйте мембрану под инвертированным микроскопом, чтобы подтвердить деэпителизацию. Затем промыть деэпителиализованную амниотическую мембрану стерильным сбалансированным солевым раствором, как показано ранее, и поместить ее в двухмиллилитровую микроцентрифужную трубку.
Затем погрузите трубку, содержащую мембрану, в жидкий азот на 40 минут. После замораживания жидким азотом вручную измельчите мембрану в течение двух-трех минут в растворе, предварительно охлажденном при минус 85 градусах Цельсия, до получения мелкодисперсного порошка. Далее добавляют 2,5 миллилитра раствора ингибитора протеазы и солюбилизируют мелкопорошковую мембрану.
Очистите стенки раствора с помощью скальпельного ножа и перенесите смесь в пятимиллилитровую трубку. Вихрь трубки в течение 30 секунд. Затем гомогенизируют тканевую смесь, сначала центрифугируя при 34 г в течение 20 минут при четырех градусах Цельсия, и сразу же центрифугируя ее снова при 3, 360 г в течение 20 минут при четырех градусах Цельсия.
В конце центрифугирования соберите супернатант, который является экстрактом амниотической мембраны, в новую трубку. Затем аликвот 0,7 миллилитров в другой двухмиллилитровой микроцентрифужной трубке для различных временных точек и температур. Общее количество белка и концентрация люмикана в экстракте амниотической мембраны зависели от времени и условий хранения.
Концентрация базального белка была одинаковой среди всех экстрактов амниотической мембраны. Однако значительно высокая концентрация белка была отмечена в экстракте, хранящемся в течение 32 дней при четырех градусах Цельсия и 20 дней при минус 20 градусах Цельсия. Люмикан в экстракте амниотической мембраны был значительно выше в образце, хранящемся в течение 12 дней, по сравнению с образцами, хранящимися в течение 30, 20 и шести дней при четырех и минус 20 градусах Цельсия.
Эти результаты показали, что соответствующее время хранения и температура для достижения самой высокой концентрации люмикана составляет 12 дней при минус 20 градусах Цельсия. Проявляйте максимальную осторожность при заземлении замерзшей амниотической оболочки. Заземление должно быть мягким, так как оно может выпасть из раствора.
Необходимы дальнейшие исследования для определения роли люмикана экстракта амниотической мембраны в эпителиальных клетках роговицы и определения идеальной дозы люмикана для реэпителизации роговицы.
Просмотрите полный транскрипт и получите доступ к тысячам научных видео
Обзор
В данном протоколе описан метод экстракции люмикана из амниотической мембраны (АМ) и его хранения при различных условиях. В исследовании количественно оценивается концентрация белка и люмикана в течение различных периодов времени.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Нейронаука
- Биохимия
- Клеточная биология
Теоретическая часть
- Люмикан представляет собой протеогликан, участвующий в различных биологических процессах.
- Амниотическая мембрана является богатым источником белков и факторов.
- Понимание условий хранения имеет решающее значение для сохранения целостности белков.
- Данный метод может быть адаптирован для других биологических тканей.
Цель исследования
- Разработать надежный протокол экстракции люмикана.
- Оценить влияние различных условий хранения на стабильность люмикана.
- Предложить базовый метод экстракции белков из биологических мембран.
Используемые методы
- Размораживание образцов амниотической мембраны.
- Промывание мембраны стерильным сбалансированным солевым раствором.
- Инкубация с диспазой II для экстракции белков.
- Хранение экстракта амниотической мембраны при различных температурах для последующего анализа.
Основные результаты
- Успешное извлечение люмикана из амниотической мембраны.
- Количественное определение концентрации белка при различных условиях хранения.
- Стабильность люмикана изменяется в зависимости от температуры и времени.
- Протокол может быть адаптирован для других белков из различных источников.
Выводы
- Метод экстракции эффективен для получения люмикана.
- Условия хранения существенно влияют на стабильность белка.
- Данный протокол может способствовать дальнейшим исследованиям белков амниотической мембраны.
Часто задаваемые вопросы
Практическая значимость для отрасли
Надежное извлечение и количественное определение люмикана из амниотической перепонки человека обеспечивает стандартизированный доступ к биоактивному компоненту матрикса, который может иметь важное значение для исследований в области восстановления тканей и органов зрения. Понимание стабильности люмикана при определенных условиях хранения способствует созданию воспроизводимых рабочих процессов и обоснованию решений по биопереработке для трансляционного применения. Данный протокол представляет извлечение люмикана как многократно используемую методику для ранних этапов биофармацевтических исследований и разработок (R&D), а также для создания биоматериалов.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Первичный поиск и валидация мишени
- Позволяет исследовать биологическую роль люмикана в организации внеклеточного матрикса и эпителизации.
- Обеспечивает функциональную валидацию люмикана как кандидата для исследований в области регенеративной медицины.
- Способствует снижению механистических рисков за счет предоставления стандартизированных препаратов люмикана для исследований in vitro.
Скрининг и разработка анализа
- Обеспечивает воспроизводимый источник люмикана для калибровки анализа и скрининга соединений.
- Позволяет проводить количественную оценку концентрации люмикана в контролируемых условиях хранения.
- Способствует стандартизации анализа путем определения оптимальных параметров экстракции и хранения.
Трансляционные и доклинические исследования
- Обеспечивает экстракты, обогащенные лютиканом, для доклинической оценки в моделях восстановления роговицы, релевантных для данного заболевания.
- Обеспечивает непрерывность процесса от этапа открытия до доклинической валидации за счет сохранения целостности белка в интервалах между периодами хранения.
- Поддерживает принятие обоснованных решений о дальнейшем продвижении с учетом рисков путем уточнения профилей стабильности лютикана.
Интеграция конвейеров и рабочих процессов
Данный протокол экстракции и количественного определения подходит для этапов от ранних открытий до доклинических исследований, поддерживая как исследования, основанные на гипотезах, так и разработку трансляционных биоматериалов.
- Открывающая биология: предоставляет платформу для тестирования механических эффектов люмикана на поведение клеток и сборку матрикса.
- Скрининг: обеспечивает получение стандартизированных препаратов люмикана для воспроизводимой разработки анализов и оценки соединений.
- Аналитика: позволяет проводить количественное измерение концентрации люмикана для сравнения условий хранения и оптимизации рабочих процессов.
- Трансляционные исследования: сохраняет целостность экстракта для последующих доклинических исследований на моделях восстановления тканей.
- Корпоративное повторное использование: устанавливает протокол, адаптируемый для экстракции других белков из биологических мембран.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: Повышает прогностическую уверенность в функциональной роли и стабильности люмикана.
- Операционная ценность: Стандартизирует экстракцию и хранение, улучшая воспроизводимость и масштабируемость.
- Стратегическая ценность: Служит основанием для принятия решений о продолжении или прекращении программ по биоматериалам и регенеративной медицине.
- Влияние на портфель: Позволяет проводить приоритизацию инициатив по исследованиям и разработкам на основе люмикана с учетом рисков.
Особенности реализации
- Требуется опыт в методах экстракции и количественного определения белков.
- Необходим доступ к оборудованию для холодного хранения, центрифугированию и реагентам-ингибиторам протеаз.
- Требуется межгрупповая стандартизация протоколов экстракции и хранения.
- Метод может быть адаптирован для других типов тканей путем оптимизации протокола.
- Согласно протоколу, необходимо осторожное обращение при измельчении во избежание потери образца.
