Сбор экссудатов корня люцерны для изучения влияния ди(2-этилгексил)фталата на продукцию метаболитов

В этом протоколе описывается, как оценить влияние ксенобиотиков на люцерну при нецелевом анализе метаболомики. Методика очень проста и удобна в эксплуатации, и можно выделить больше типов корневых экссудатов. Это помогает построить метаболомную дактилоскопию экссудатов корня растения.

Начните стерилизацию семян люцерны medicago sativa, промыв семена 0,1% гипохлоритом натрия в течение 10 минут. Затем промывание 75%-ным этиловым спиртом в течение 30 минут. Далее несколько раз промойте стерилизованные семена дистиллированной водой.

А затем прорастите их на влажной фильтровальной бумаге, помещенной в стерильную чашку Петри. При 30 градусах Цельсия в темноте. После прорастания переложите 20 равномерно проросших больших пухлых семян в корзину для приживления в бутылке с культурой, наполненной питательным раствором.

Поместите все бутылки с культурой в камеру для выращивания с контролируемыми условиями. Через две недели пересадите 15 однородных саженцев люцерны в новую стеклянную бутылку, чтобы подвергнуть их воздействию одного миллиграмма на килограмм и 10 миллиграммов на килограмм стресса DEHP для эксперимента с культурой. Оберните стеклянные бутылки для обработки и контроля алюминиевой фольгой и парапленкой, чтобы предотвратить фотолиз и улетучивание DEHP.

Ежедневно дополняйте питательный раствор, чтобы поддерживать уровень жидкости. Случайным образом размещайте и вращайте бутылки каждые два дня, чтобы обеспечить постоянные условия роста для саженцев люцерны. После семи дней выращивания извлеките рассаду люцерны из бутылок.

И несколько раз промыть их сверхчистой водой, чтобы подготовить к сбору корневых экссудатов. Начните эксперимент по сбору корневого экссудата, переложив 10 однородных саженцев люцерны в центрифужные пробирки, заполненные 50 миллилитрами стерилизованной деионизированной воды. Чтобы собрать корневые экссудаты, держите трубки в вертикальном положении в течение шести часов, погрузив корни в воду.

После этого оберните пробирки центрифуги алюминиевой фольгой, чтобы защитить корни от света. Удалите растения и высушите собранную жидкость для профилирования метаболитов. Продолжите экстракционный эксперимент, добавив 1,8 миллилитра экстракционного раствора к лиофилизированным образцам.

В вихре 30 секунд. Затем приложите ультразвуковые волны к трубкам на 10 минут на ледяной водяной бане. Перед центрифугированием образцов.

Осторожно перелейте 200 микролитров надосадочной жидкости в микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 миллилитра. Аспирируйте 45 микролитров надосадочной жидкости из центрифужной пробирки и смешайте ее с образцами контроля качества или контроля качества в конечном объеме 270 микролитров. После этого высушите экстракты вымораживанием в вакуумном концентраторе.

После завершения сушки добавьте пять микролитров внутренней стандартной рибонуклеазы и продолжайте сушку. После испарения добавьте 30 микролитров раствора гидрохлорида метоксиаминирования и инкубируйте пробирки при 80 градусах Цельсия в течение 30 минут. Затем добавьте 40 микролитров реагента BSTFA в образцы перед помещением пробирок при температуре 70 градусов Цельсия на 1,5 часа для дериватизации.

После завершения инкубации и нахождения дериватизированного образца при комнатной температуре добавьте к дериватизированным образцам пять микролитров метиловых эфиров жирных кислот, растворенных в хлороформе. Используя капиллярную колонку размером 30 метров на 250 микрометров на 0,25 микрометра, отделите один микролитр корневого экссудата газом-носителем гелием со скоростью потока 1,0 миллилитра в минуту. Установите температуру впрыска на 280 градусов по Цельсию.

И поддерживайте температуру линии передачи на уровне 280 градусов по Цельсию. Установите программу духовки на разделение. После отделения экстрактов проводят масс-спектрометрию в режиме столкновения электронов с энергией минус 70 электрон-вольт.

Поддерживайте температуру источника ионов на уровне 250 градусов по Цельсию. Получение масс-спектров в режиме мониторинга полного сканирования с диапазоном масс-сканирования от 50 до 500 масс по зарядке со скоростью 12,5 спектров в секунду. В хроматографе контрольного образца было обнаружено 778 пиков.

Из них 314 метаболитов были идентифицированы по масс-спектрам. Кислоты были далее подразделены на жирные кислоты, аминокислоты, органические кислоты и фенольные кислоты. Кроме того, некоторые распространенные вещества, обычно присутствующие в корневых экссудатах, были также обнаружены в экссудатах корня люцерны, включая пиримидины, гидроксипиримидины, флавоноиды, фенолы, кетоны, пиримидины и дитерпены.

Тепловая карта была построена на основе оценки VIP, чтобы визуализировать различия в дифференциальных метаболитах между различными видами лечения DEHP. По сравнению с контрольными образцами воздействие DEHP достоверно изменило содержание 50 метаболитов и экссудатов корня люцерны. В основном включает в себя некоторые углеводы и низкомолекулярные органические кислоты.

Анализ метаболических путей показал, что DEHP значительно ингибирует метаболизм углеводов, которые являются продуктом фотосинтеза, что указывает на то, что DEHP может подавлять фотосинтез люцерны в определенной степени. По крайней мере, экссудаты корня семян следует проводить для каждой обработки, чтобы обеспечить точный анализ метаболомных данных. Мы можем определить дифференциальный метаболизм и дополнительно исследовать важные правила поведения загрязняющих веществ в окружающей среде.

Взаимодействия между растениями и более широким полевым биологическим сообществом могут быть расшифрованы в основном с помощью этого метода.