Скрининговый анализ с высоким содержанием для идентификации антителозависимых соединений, модифицирующих клеточную цитотоксичность

Антителозависимая клеточная цитотоксичность, или сокращенно ADCC, может быть опосредована естественными клетками-киллерами, которые мы называем NK-клетками, гранулоцитами и макрофагами. Это эффекторные клетки ADCC. Если антитело, такое как трастузумаб, которое нацелено на рецептор эпидермального фактора роста HER2, связывается с опухолевыми клетками, то эти эффекторные клетки используют свои рецепторы FcyR для связывания постоянной области FC антител.

Антитело соединяет опухолевые клетки и эффекторные клетки, несущие рецептор FcyR, вызывая высвобождение их цитотоксических гранул. Это приводит к апоптозу раковых клеток. ADCC может быть эффективен против опухолей, которые не реагируют на антипролиферативные эффекты трастузумаба.

Чтобы настроить систему ADCC, нам необходимо провести совместную инкубацию анти-HER2-положительных клеток карциномы молочной железы JIMT-1 с клеточной линией NK-92 в присутствии антитела против HER2 трастузумаба. Клеточная линия JIMT-1, которую мы используем для анализа, стабильно экспрессирует зеленый флуоресцентный белок. Во-первых, закодируйте 96-луночную просеивающую пластину с высоким содержанием среды JIMT.

Пипеткой наберите 50 микролитров среды в каждую лунку пластины. Поместите тарелку в CO2-инкубатор на один час. Покрытие имеет решающее значение для крепления ячеек JIMT-1 к стеклянной поверхности пластины.

На этапе нанесения покрытия трипсинизируют клетки JIMT-1. Промойте клетки двумя миллилитрами стерильного PBS. Затем добавьте в колбу один миллилитр трипсина-ЭДТА.

Поместите колбу обратно в CO2-инкубатор на 10 минут. После инкубации постучите по колбе, чтобы проверить, отсоединились ли клетки JIMT-1. Остановите пищеварение с помощью двух миллилитров среды JIMT-1 и соберите клеточную суспензию в 15-миллилитровую пробирку.

Затем подсчитайте клетки JIMT-1 с трипановым синим в синей камере. Отрегулируйте количество ячеек до 133 000 клеток на мл. Аспирируйте среду покрытия, а затем добавьте 75 микролитров клеточной суспензии в каждую лунку.

Дайте клеткам прикрепиться во время ночной инкубации при температуре 37 градусов Цельсия в CO2-инкубаторе. На следующий день аспирируйте среду и добавьте 50 микролитров свежей среды JIMT-1 в лунки, а затем перенесите пластину в высокопроизводительную лабораторию скрининга. Робот используется для переноса тестовых соединений на микропланшеты с высоким содержанием.

С помощью роботизированной руки робот захватывает штифтовый инструментальный блок, который откалиброван для передачи 25 нанолитров. Перенесите в общей сложности 100 нанолитров испытуемых соединений с библиотечной пластины соединений на аналитическую пластину в четыре этапа. Убедитесь, что конечная концентрация исследуемых соединений составляет 20 мкмоль.

Между каждым этапом сначала промывают штифтовый инструмент в 50% ДМСО, а затем в 70% этаноле. Инкубируйте тарелку в течение одного часа в CO2-инкубаторе при температуре 37 градусов Цельсия. Культивирование NK-клеток в колбах для культивирования тканей Т25.

Пока продолжается медикаментозное лечение клеток JIMT-1, соберите NK-клетки из колбы T25 в 15-миллилитровую центрифужную пробирку. Подсчитайте клетки NK-92 с трипановым синим в синей счетной камере. Отрегулируйте количество ячеек до 400 000 клеток на мл.

Центрифугу объемом суспензии NK-клеток, содержащей 400 000 клеток на мл в 150 г, в течение трех минут при комнатной температуре. Приготовьте среду ADCC, добавив 20 мкг на мл трастузумаба против антител к HER2 в среду JIMT-1. Пипетка 20 000 NK-клеток в 50-микролитровой среде ADCC до целевых клеток JIMT-1 GFP.

Конечный объем составляет 100 микролитров, а конечная концентрация трастузумаба составляет 10 микрограмм на мл. Поместите пробирную пластину в аналитическое оборудование с высоким содержанием, которое имеет встроенный инкубатор, установленный на 37 градусов по Цельсию. Пластины изображены в двух временных точках.

Во-первых, мы получаем изображения сразу после добавления эффекторных клеток к клеткам-мишеням, а второй набор изображений делается через три часа после добавления NK-клеток. Во-первых, выберите тип микропланшета. Используйте 96-луночные просеивающие пластины с высоким содержанием.

Выберите, чтобы выбрать фокус, потому что анализ проводится на планшетах с 10-кратным объективом в неконфокальном режиме. Выберите объединение два, чтобы удвоить отношение сигнал/шум. Выберите подходящие каналы, время экспозиции, мощность лазера, плоскость фокусировки и длину волны.

Возьмите изображения светлого поля на 650-760 нанометрах и обнаружите EGFP-трансдуцированные ячейки JIMT-1 с возбуждением 488 нанометров и длиной волны излучения 500-550 нанометров. Перед началом измерения возьмите образцы изображений с функцией моментального снимка, чтобы проверить правильность настроек. Наконец, установите количество полей и количество временных точек для изображения.

Выберите, например, девять полей и две временные точки. Чтобы проанализировать эффективность ADCC, подсчитайте жизнеспособные клетки JIMT-1 в контрольной скважине ADCC. Используйте модуль мелких ячеек для обнаружения областей на изображении, соответствующих ячейкам.

Определите каждую ячейку как область на изображении, которая имеет более высокую интенсивность флуоресценции, чем ее окружение. Выберите ячейки с помощью встроенного алгоритма M с диаметром 80 микрометров. Установите для параметра чувствительности к разделению, который разделяет большой объект на более мелкие объекты, значение 0,5.

Установите общий порог, который является самым низким уровнем интенсивности пикселей, равным нулю. Исключить обнаружение фоновой области с высокой интенсивностью флуоресценции EGFP можно в два этапа. Во-первых, примените функцию расчета свойств интенсивности, чтобы определить интенсивность флуоресценции EGFP в ранее выбранной области клеток.

После этого установите минимальный и максимальный порог интенсивности с помощью опции выбора популяции, чтобы получить количество жизнеспособных клеток-мишеней JIMT-1 GFP в конце ADCC. Рассчитайте эффективность ADCC, разделив номер ячейки, обнаруженной через три часа, на номер ячейки, обнаруженный в нулевое время. Мы хотели бы продемонстрировать практическое применение нашего метода с репрезентативными результатами.

Мы установили тестовую пластину с 16 соединениями, случайно взятыми с полок. Мы также включили три соединения: колхицин, винкристин и подофиллотоксин с ожидаемым ингибирующим действием ADCC. В качестве отрицательного контроля использовался ДМСО.

Каждый препарат использовался в четырех повторах на пластине. На рисунке показан результат тестового экрана. В группе минуса NK проверялась токсичность препаратов на клетках JIMT-1.

В группе плюса NK были добавлены NK-клетки и трастузумаб, которые вызывали примерно 50% цитотоксичности. Ожидаемый эффект ингибитора ADCC трех испытуемых соединений может быть обнаружен с помощью анализа. Мы создали систему анализа совместной культуры, моделирующую клинически значимое взаимодействие между клетками рака молочной железы, NK-клетками и терапевтическим моноклональным антителом трастузумабом.

Анализ основан на автоматизированной микроскопии в сочетании с анализом изображений и подходит для скрининга библиотек химических соединений для идентификации препаратов, модифицирующих ADCC. Процедура потенциально может быть использована для идентификации адъювантных молекул, которые потенцируют противоопухолевый ответ, или для идентификации химических веществ с неблагоприятным эффектом.