Динамический сбор внеклеточной жидкости гиппокампа у крыс, находящихся в сознании, в режиме реального времени с использованием системы микродиализа
21 октября 2022 г.
Протокол обеспечивает подробный динамический отбор проб внеклеточной жидкости из гиппокампа бодрствующих крыс в режиме реального времени с использованием системы микродиализа.
Внеклеточная жидкость гиппокампа и толпа с помощью метода микродиализа мозга способствуют мониторингу специфических микрозаболеваний центральной нервной системы. Технический микродиализ головного мозга обеспечивает динамическое и непрерывное исследование интерстициальной мозговой жидкости в определенных областях мозга крыс, не подвергшихся анестезии. Начните с фиксации анестезированной крысы на стереотаксическом локаторе мозга и трижды протрите выбритую операционную область тампоном повидон-йода и этанолом перед операцией.
Затем хирургическими ножницами сделайте 1,5-сантиметровый черепно-лицевой разрез посередине и удалите надкостницу хирургическими ножницами и офтальмологическими щипцами. Рассматривая брегму как базальное положение, с помощью черепного сверла проткните эндокраниум, чтобы просверлить двухмиллиметровое отверстие в области CA1 гиппокампа. Теперь закрепите шпильку катетера на захвате стереотаксического локатора мозга и отрегулируйте положение оболочки микродиализа в переднезаднем, медиолатеральном и дорсальном вентральном положениях.
Отрегулируйте дорсовентральный клапан стереолокатора головного мозга и имплантируйте корпус микродиализа в область CA1 на глубине 3,5 миллиметра. Просверлите еще три отверстия диаметром два миллиметра таким образом, чтобы три отверстия образовывали треугольник, в котором отверстие зонда расположено по центру. Ввинчивают имплантаты в отверстия на глубине одного миллиметра и фиксируют зондирующий катетер зубным цементом.
Затем используйте хирургический шов 4-O, чтобы закрыть кожу. Соедините микрошприц микродиализного насоса с устройством пробуждения ACSF и коллектором криогенных образцов в соответствии с инструкциями производителя. Далее, чтобы выпустить воздух в трубопровод, установите микродиализный насос со скоростью один микролитр в минуту.
Затем соедините трубопровод и зонд микродиализа мозга и запустите микродиализный насос со скоростью один микролитр в минуту, чтобы вводить ACSF в зонд до тех пор, пока поверхность зонда не станет слегка влажной. Погрузите зонд в раствор для инъекций гепарина натрия для последующего использования. Чтобы собрать HECF у бодрствующей крысы, вставьте зонд микродиализа мозга в катетер зонда и поместите крысу в камеру с набивкой, чтобы крысы могли свободно передвигаться.
Включите многоканальный поворотный контроллер, чтобы избежать переплетения трубопроводов микродиализа во время свободного движения крысы. Затем включите микрошприцевую помпу и перекачивайте ACSF со скоростью один микролитр в минуту. После 60-минутного уравновешивания микродиализной системы сбора HECF периодически собирайте HECF.
После завершения отбора проб извлеките зонд микродиализа головного мозга из зондового катетера. Погрузите зонд в деионизированную воду и промыть деионизированной водой на 12 часов, чтобы удалить многожильные отложения солей из трубопровода и зонда. Извлеките зонд и поместите его в 0,05% раствор трипсина при температуре четыре градуса Цельсия.
Внеклеточная жидкость гиппокампа, полученная методом микродиализа мозга, похожа на воду, бесцветна и прозрачна с заданной частотой дискретизации. Наиболее важными процедурами являются аккуратная имплантация микродиализа в область CA1 и введение зонда в катетер. Метод микродиализа позволяет помочь динамическому изменению маркеров заболевания в определенных областях мозга, веществу эффективности препарата и катаболизму компонентов препарата в тканях.
Просмотрите полный транскрипт и получите доступ к тысячам научных видео
Обзор
В данной статье представлен протокол динамического отбора проб внеклеточной жидкости гиппокампа (HECF) в режиме реального времени у бодрствующих крыс с использованием метода микродиализа мозга. Данный процесс позволяет исследователям отслеживать специфические маркеры при заболеваниях центральной нервной системы путем непрерывного забора проб из конкретных областей мозга без применения анестезии к подопытным животным.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Нейронауки
- Нейродегенеративные заболевания
- Методы микродиализа
Теоретические сведения
- Понимание динамики внеклеточной жидкости имеет решающее значение для изучения нейронных механизмов и пластичности.
- Современные методы обычно предполагают использование инвазивных техник, которые могут влиять на биологический контекст.
- Микродиализ позволяет собирать интерстициальную жидкость у бодрствующих субъектов, что обеспечивает получение более релевантных данных.
- Данный протокол отвечает потребности в непрерывном мониторинге состава жидкости мозга на живых моделях.
Цель исследования
- Улучшить мониторинг маркеров заболеваний в гиппокампе путем внедрения метода неинвазивного отбора проб.
- Предоставить подробную методологическую базу для воспроизведения данной процедуры исследователями.
- Создать надежную систему для наблюдения за эффектами препаратов и метаболическими изменениями в динамике.
Используемые методы
- В исследовании используется система микродиализа, имплантированная в область CA1 гиппокампа.
- В качестве биологической модели для отбора проб HECF используются бодрствующие неанестезированные крысы.
- Метод микродиализа позволяет измерять жидкость со скоростью 1 µL в минуту.
- Критически важные этапы включают точную имплантацию катетера, уравновешивание и регулярные интервалы отбора проб.
- После отбора проб проводится очистка зонда для микродиализа для обеспечения достоверности данных.
Основные результаты
- Собранная жидкость из полости мозга (HECF) прозрачная и бесцветная, что позволяет проводить анализ маркеров заболеваний.
- Детально проработанная методика позволяет исследовать динамические изменения в нейрональном окружении.
- Информация, полученная с помощью этого метода, может помочь в оценке эффективности лекарственных препаратов и понимании механизмов катаболизма тканей.
Выводы
- Данное исследование демонстрирует потенциал микродиализа в расширении нашего понимания динамики жидкостей мозга и патологических процессов.
- Возможность непрерывного мониторинга позволяет оценивать изменения действия препаратов и метаболических состояний в режиме реального времени.
- Эти данные имеют решающее значение для совершенствования стратегий лечения неврологических заболеваний.
Часто задаваемые вопросы
Значимость для промышленности
Динамический сбор внеклеточной жидкости гиппокампа (HECF) в режиме реального времени у крыс в сознании позволяет осуществлять прямой мониторинг нейрохимических изменений, имеющих значение для прогрессирования заболеваний ЦНС и эффективности лекарственных средств. Эта возможность повышает прогностическую достоверность в трансляционной нейробиологии, обеспечивая количественные данные о биомаркерах с временным разрешением из релевантных заболеванию областей мозга. Данный подход способствует раннему обнаружению и механистическому снижению рисков при разработке нейротерапевтических портфелей, нацеленных на пути гиппокампа.
Стратегическое применение в исследованиях и разработках биофармацевтики
Ранний поиск и валидация мишени
- Позволяет исследовать нейрохимическую динамику, лежащую в основе механизмов заболеваний ЦНС in vivo.
- Обеспечивает функциональную валидацию мишеней путем количественной оценки эффектов препаратов и метаболитов в гиппокампе.
- Способствует снижению механистических рисков за счет прямого измерения значимых для заболевания внеклеточных маркеров.
Скрининг и разработка методов анализа
- Обеспечивает валидированный количественный отбор проб внеклеточной жидкости мозга для последующего скрининга соединений.
- Позволяет проводить воспроизводимый стандартизированный сбор нейрохимических данных на моделях бодрствующих животных.
- Поддерживает разработку анализов для оценки фармакодинамического ответа на соединения, активные в центральной нервной системе.
Трансляционные и доклинические исследования
- Позволяет соотнести измерение преклинических биомаркеров с конечными точками, релевантными заболеванию, в трансляционной нейробиологии.
- Обеспечивает непрерывность процесса от этапа поиска до преклинической валидации за счет отслеживания динамики действия препарата in vivo.
- Поддерживает принятие решений о продвижении проекта с учетом рисков на основе нейрохимических показателей в режиме реального времени.
Интеграция конвейера и рабочего процесса
Данный метод микродиализа интегрируется в континуум от этапа поиска до доклинических исследований, обеспечивая количественный анализ внеклеточной жидкости гиппокампа у крыс в сознании в режиме реального времени.
- Поиск биологических мишеней: Поддерживает проверку гипотез и уточнение сигнальных путей для мишеней в ЦНС путем мониторинга динамических изменений биомаркеров.
- Скрининг: Обеспечивает воспроизводимые нейрохимические данные, готовые для использования в анализах при оценке соединений.
- Аналитика: Предоставляет количественные данные для сравнения эффектов препаратов и состояний заболевания в различных экспериментальных условиях.
- Трансляционные исследования: Связывает доклинические и трансляционные исследования путем приведения измерений биомаркеров в соответствие с клиническими конечными точками.
- Корпоративное повторное использование: Создает многократно используемую платформу для рабочих процессов по поиску лекарств для ЦНС и валидации биомаркеров.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: повышает прогностическую достоверность и снижает механистическую неопределенность при валидации мишеней ЦНС.
- Операционная ценность: стандартизирует отбор нейрохимических проб и повышает воспроизводимость результатов между исследованиями.
- Стратегическая ценность: улучшает процесс принятия решений о продолжении или прекращении разработки (go/no-go) и повышает эффективность использования капитала за счет предоставления практически значимых данных о биомаркерах.
- Влияние на портфель: позволяет проводить приоритезацию кандидатов для нейротерапии с учетом рисков на основе динамических доказательств in vivo.
Особенности реализации
- Требуется опыт проведения стереотаксических операций и имплантации микродиализных зондов.
- Необходимо специализированное оборудование для отбора проб методом микродиализа и их количественного анализа.
- Требуется межгрупповая стандартизация частоты отбора проб и аналитических протоколов.
- Адаптация метода для различных областей мозга или моделей заболеваний может потребовать оптимизации протокола.
- Отбор проб ограничен аналитами с массой ниже 20 kDa в соответствии с характеристиками порога отсечения зонда.
Часто задаваемые вопросы по биофармацевтике
Chapters in this video
0:04
Introduction
0:44
Brain Microdialysis Probe Implantation Surgery
2:24
Microdialysis System Connection and Probe Check
3:15
Collection of Hippocampal Extracellular Fluid (HECF) from the Awake Rat
4:02
Maintenance of the Microdialysis System and Devices After Sampling
4:36
Results: Analysis of HECF Collected Using the Microdialysis Sampling Equipment
4:54
Conclusion
