Цифровые схемы генов на основе систем CRISPR-Cas и белков анти-CRISPR

Наш протокол объясняет, как проектировать, создавать и анализировать цифровые схемы генов дрожжей, в которых используются системы CRISPR dCas второго и пятого типов и соответствующие белки анти-CRISPR. Это сборка, потому что она собирает ноль стандартных процедур для сборки и тестирования синтетических транскрипционных сетей в сервисах. Для начала приготовьте реакционную смесь, содержащую от 20 до 40 нанограммов матрицы ДНК, один микролитр прямого праймера, один микролитр обратного праймера, пять микролитров смеси DNTP, 0,5 микролитра ДНК-полимеразы, 10 микролитров 5-кратного реакционного буфера ДНК-полимеразы и двойную дистиллированную воду до общего объема 50 микролитров.

Амплификация последовательностей ДНК с помощью программы ПЦР на термоциклере, как описано в рукописи. Изолируйте продукты ПЦР с помощью гель-электрофореза и разбавьте последовательности ДНК из агарозного геля с помощью набора для экстракции геля ДНК. Используя метод сборки Гибсона, вставьте очищенные продукты ПЦР в разрезанный вектор челнока, впустив эквимолярную смесь ДНК при температуре 50 градусов Цельсия в течение одного часа.