Применение проточной вермиметрии для количественной оценки и анализа микробиома кишечника Caenorhabditis elegans
31 марта 2023 г.
Caenorhabditis elegans является мощной моделью для изучения молекулярных детерминант, управляющих взаимодействием между хозяином и микробиомом. Мы представляем высокопроизводительный конвейер, профилирующий уровни колонизации микробиома кишечника у отдельных животных, а также ключевые аспекты физиологии C. elegans.
Микробиом кишечника играет важную роль в формировании физиологии хозяина. Этот протокол, в частности, позволяет с высокой пропускной способностью оценивать уровни колонизации флуоресцентных кишечных микробов у одиночных клеточных животных в больших масштабах. Одним из основных преимуществ этого метода является возможность мониторинга микробиома кишечника живых животных в режиме реального времени, что позволяет идентифицировать и соотносить любые изменения с физиологией хозяина.
Процедуру будет демонстрировать Дана Блэкберн, научный сотрудник моей лаборатории. Начните с смывания червей с бактериального газона одним-двумя миллилитрами M9-TX. Переложите червей в стерилизованную двухмиллилитровую тарелку глубиной 96 лунок.
Гранулируйте их при 300 G в течение одной минуты и удалите жидкость с помощью аспирационного коллектора. Используя многоканальную пипетку объемом 1,2 миллилитра, добавьте 1,8 миллилитра M9-TX в каждую лунку глубокой лунки, перемешайте пипеткой пару раз и центрифугируйте при 300 G в течение одной минуты. После окончательной промывки доведите объем в каждой лунке до 100 микролитров, используя аспирационный коллектор.
Добавьте в каждую лунку по 100 микролитров 10 миллимолярного левамизола и М9-Т и дайте червям парализоваться в течение пяти минут. Затем добавьте 4%-ный раствор отбеливателя в каждую лунку на две минуты, чтобы уменьшить скопление бактерий. После обработки отбеливателем добавьте M9-TX в каждое углубление пластины, чтобы промыть червей.
Центрифугируйте пластину и аспирируйте до конечного объема 100 микролитров после второй промывки. Переложите червей на плоскодонную 96-луночную пластину, содержащую 150 микролитров 10 миллимоль левамизола и M9-TX. Поддерживайте плотность червей на уровне от 50 до 100 червей на лунку и разделяйте червей на несколько лунок, если популяция слишком скучена.
Включите воздушный компрессор, компьютер и прибор LPS. Проверьте и опорожните бак для отходов. Проверьте и заправьте чехол и резервуары для воды, если объем недостаточен.
Убедитесь, что 250-микрометровый жидкостный и оптический сердечник на месте. Подключите и включите автосамплер. Откройте программное обеспечение автосамплера, чтобы открыть автосамплер и программное обеспечение LPS.
В окне программного обеспечения LPS перейдите в файл и нажмите кнопку «Новый эксперимент», затем снова выберите файл и нажмите кнопку «Новая проверка образца». Включите лазеры с длиной волны 488 и 561 нм, если это еще не сделано. Теперь создайте шаблоны для точечных диаграмм захвата, используя каналы времени пролета, экстинкции и флуоресцентные каналы в окне программного обеспечения LPS.
Щелкните правой кнопкой мыши в теле диаграммы, чтобы изменить масштабирование. Далее загружают контрольные образцы. В окне автосамплера выбираем prime, переходим к файлу, нажимаем открыть скрипт, чтобы выбрать нужный встроенный скрипт и нажимаем ОК.
Перейдите к шаблону пластины в меню программного обеспечения пробоотборника, чтобы выбрать нужные лунки для анализа. После загрузки и закрепления пластины на столике автосамплера нажмите кнопку запуска пластины в окне автосамплера и сохраните файл при появлении запроса, затем нажмите кнопку сохранения текущих данных на верхней ленте в окне программного обеспечения LPS и снова сохраните данные. Откройте программное обеспечение LPS.
Перейдите к файлу и выберите новый эксперимент, затем вернитесь к файлу и нажмите кнопку Создать образец. Постройте точечную диаграмму со временем пролета по оси X и затуханием по оси Y. Создайте еще одну точечную диаграмму со временем полета на оси X и красным цветом на оси Y.
Обязательно установите флажок включения лазеров для активации лазеров 488 и 561 нм. Поместите пробирку с контрольным образцом на отверстие для отбора проб, затем нажмите кнопку «Получить» в диалоговом окне «Получение и дозирование». При появлении запроса обязательно сохраните файл.
После того, как будет измерено достаточное количество червей для дифференциации популяций, выберите abort на точечной диаграмме, показывающей время полета и вымирания. Нарисуйте ворота вокруг области, представляющей взрослое население. Затем перейдите к просмотру, щелкните иерархию стробирования и убедитесь, что флуоресцентные вентили правильно перечислены под гейтом взрослой популяции.
На графике «Время полета и красная точка» создайте ворота вокруг областей с высоким и низким значением красного цвета, чтобы выделить интересующие области, показывающие колонизацию микробиома у взрослых червей. После оптимизации настроек перейдите к файлу и нажмите кнопку Сохранить эксперимент, затем нажмите кнопку Файл и выберите Сохранить образец. Чтобы загрузить сборное устройство, выберите загрузочную пластину A, чтобы позволить ступени сбора переместиться в положение, подготовленное для загрузки либо сборной трубы, либо 96-луночной пластины.
Для дозирования на 96-луночный планшет перейдите в раздел настройки и выберите пластины, затем нажмите на калиброванные планшеты и выберите 96-луночный планшет. Далее выбираем лунки, в которые будут сортироваться черви, и вводим количество объектов, которые нужно отсортировать в каждую лунку. Не забудьте также указать интересующие вас закрытые регионы.
Если в одну и ту же пластину сортировано несколько закрытых областей, обязательно установите флажок с надписью «Затвор» в каждом колодце. Нажмите кнопку ОК, чтобы сохранить изменения. После сортировки номеров и назначения местоположений загрузите пробу в отверстие для отбора проб и нажмите кнопки заполнения пластины в диалоговом окне получения и дозирования, чтобы начать дозирование в планшет на 96 лунок.
Более высокие значения удлинения и времени лёта наблюдаются у взрослых особей по сравнению с личинками. У потомства от двухдневных взрослых особей преобладали стадии L1 и L2, в то время как большинство потомства от трехдневных взрослых достигли стадий L3 и L4. При выращивании на E.coli время полета и удлинение увеличивались на третий день по сравнению со вторым.
При выращивании на охробактруме, BH 3 и смешанных культурах cenor abdidas allegands показали различия во времени полета и значениях удлинения. Повышенная колонизация ochrobactrum BH3 наблюдалась в смешанном состоянии, чем при использовании только ochrobactrum BH3. Напротив, зеленые флуоресцентные значения указывали на более низкую колонизацию OP50 в смешанном состоянии, чем только в OP50.
Черви сильно перекошены к оси Y, что позволяет предположить, что колонизация OP50 у большинства червей низкая, в то время как уровни колонизации ochrobactrum, BH3 равномерно распределены в популяции. Также наблюдалась взаимосвязь между охробактрумом, уровнями колонизации BH3 и развитием хозяина, таким как плотность тела и различия в моделях размножения. У трехдневных взрослых особей, выращенных на смеси из двух членов, микробиом демонстрировал широкий диапазон интенсивности RFP, что указывает на индивидуальные различия в колонизации охробактрума в группе.
Показаны RFP-изображения скважин, содержащих 15 отсортированных и отдельных шнеков из верхних и низких затворов RFP. Самое главное — не забывать использовать соответствующие элементы управления для всех шагов, чтобы убедиться, что протокол и машина работают правильно. В режиме реального времени животные со специфическими особенностями могут быть использованы для выделения штаммов из пулов хозяев или микробных мутантов для выявления генов, которые регулируют постмикробные взаимодействия.
Изолированные животные также могут быть использованы для анализа одного животного или обогащенного фенотипического пула на основе последующих потоков, таких как РНК-секвенирование и т.. Действительно, возможности поистине безграничны.
Просмотрите полный транскрипт и получите доступ к тысячам научных видео
Обзор
В данном исследовании изучаются молекулярные детерминанты, определяющие взаимодействия между хозяином и микробиомом, используя модельный организм Caenorhabditis elegans. Был разработан высокопроизводительный конвейер для оценки уровней колонизации микробиома кишечника у отдельных червей, что позволяет сопоставить эти уровни с физиологическими состояниями червя.
Ключевые компоненты исследования
Область исследования
- Взаимодействия хозяин-микробиом
- Использование модельного организма в микробиологии
- Высокопроизводительные экспериментальные подходы
Бэкграунд
- Микробиом кишечника играет решающую роль в формировании физиологии хозяина.
- Понимание этих взаимодействий может дать представление о здоровье и заболеваниях.
- C. elegans служит эффективной моделью для изучения этих динамических процессов.
Используемые методы
- Высокопроизводительная оценка колонизации микроорганизмов у живых особей C. elegans.
- Мониторинг в реальном времени взаимодействий с использованием различных методов флуоресцентного обнаружения.
- Процедуры изоляции и обработки червей для анализа.
Основные результаты
- Демонстрируются различия в уровнях колонизации на основе микробных условий.
- Наблюдается корреляция между колонизацией микробиома и физиологическими состояниями хозяина, такими как стадии развития.
- Определяются специфические микробные эффекты на физиологические характеристики C. elegans.
Выводы
- Это исследование подчеркивает полезность C. elegans в качестве модели для изучения взаимодействий хозяин-микробиом.
- Полученные результаты имеют значение для понимания микробного влияния на биологию хозяина и потенциальных приложений в исследованиях в области здравоохранения.
Часто задаваемые вопросы
Executive Industry Relevance
Quantitative flow vermimetry enables high-throughput, real-time analysis of gut microbiome composition in live Caenorhabditis elegans, supporting mechanistic de-risking and target validation in host-microbe interaction studies. This approach provides predictive confidence for linking microbial colonization to host physiological outcomes, informing early discovery and translational research pipelines. The method's scalability and reproducibility position it as a reusable capability for portfolio-wide microbiome investigations.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of host-microbiome functional relationships using quantitative, single-animal data.
- Supports biological de-risking by correlating microbial colonization with host developmental and physiological states.
- Facilitates functional target validation through isolation of animals with defined microbiome profiles.
- Provides predictive confidence for downstream mechanistic studies and genetic screens.
Screening & Assay Development
- Prepares validated, live animal systems for high-throughput screening of microbial or host genetic variants.
- Standardizes gating and sorting strategies for reproducible quantification of microbiome colonization.
- Enables scalable, plate-based workflows for compound or genetic library evaluation.
- Delivers quantitative outputs suitable for robust statistical analysis and cross-condition comparisons.
Translational & Preclinical Research
- Aligns with disease-relevant models by enabling manipulation and measurement of microbiome composition in vivo.
- Supports continuity from discovery to preclinical validation by isolating phenotypically defined animal cohorts.
- Provides a platform for downstream omics or phenotypic analyses linked to microbiome status.
- De-risks translational hypotheses by enabling real-time, live-animal readouts of microbiome effects.
Pipeline & Workflow Integration
This method integrates from early discovery through lead identification, supporting hypothesis testing, screening, and translational research in microbiome-focused pipelines.
- Discovery Biology: Quantitative gating and sorting clarify host-microbe pathway relationships and enable mechanistic de-risking.
- Screening: High-throughput, reproducible workflows facilitate assay readiness and enable robust compound or genetic screens.
- Analytics: Fluorescent and morphological readouts provide quantitative, statistically analyzable data for condition comparison.
- Translational Research: Enables isolation of animal cohorts for downstream biomarker or omics studies aligned with disease models.
- Enterprise Reuse: Standardized protocols and instrumentation support broad adoption across discovery and translational teams.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in host-microbiome studies.
- Operational Value: Delivers scalable, reproducible, and standardized workflows for live-animal microbiome quantification.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions and capital efficiency by enabling robust, quantitative data generation.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of microbiome-related discovery programs.
Implementation Considerations
- Requires expertise in flow cytometry, microbiome biology, and C. elegans handling.
- Needs access to large particle sorters with fluorescence detection and compatible software.
- Demands rigorous control selection and cross-team standardization for gating and sorting strategies.
- Adaptation may be needed for different microbial strains or host genetic backgrounds.
- Throughput and sensitivity depend on instrument configuration and sample preparation quality.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Introduction
0:39
Collecting Worm Population for Gut Microbiome Analyses
2:08
Setting Up the Large Particle Sorter and Autosampler
3:43
Sorting of Caenorhabditis elegans by Gut Microbiome Features
6:05
Results: Profiling Gut Microbiome Colonization
7:50
Conclusion
