Изучение привыкания в Stentor coeruleus
6 января 2023 г.
Мы представляем метод количественной оценки привыкания стентора с использованием устройства, связанного с платой микроконтроллера, которое может подавать механические импульсы с заданной силой и частотой. Мы также включаем методы сборки аппарата и постановки эксперимента таким образом, чтобы свести к минимуму внешние возмущения.
Изучение привыкания на уровне одной клетки поможет охарактеризовать парадигмы обучения, которые не зависят от сложных нейронных схем, тем самым помогая нам понять происхождение интеллекта. Этот метод позволяет изменять силу и частоту механической стимуляции, доставляемой к клеткам, под автоматическим компьютерным управлением, что значительно увеличивает разнообразие входных последовательностей. Использование этих методов для изучения клеточной привыкания поможет нам узнать больше о таких состояниях, как СДВГ и синдром Туретта, при которых привыкание нарушено.
Для начала подключите драйвер двигателя к двигателю, соединив два провода с маркировкой A от платы драйвера к синим и красным проводам на двигателе. Затем подключите два провода с маркировкой B от платы драйвера к зеленым и черным проводам на двигателе. После построения макетной схемы с особой тщательностью для подключения светодиодов в правильной полярности подключите VCC от платы драйвера к верхней рейке белой макетной доски.
И грунт от доски водителя до нижней рейки макетной доски. Затем подключите заземление макетной платы к контакту заземления платы микроконтроллера. Затем подключите зеленый светодиод, красный светодиод, переключатель и кнопочные провода соответственно к цифровым контактам 8, 9, 10 и 11 платы микроконтроллера.
Подключите два и три цифровых контакта платы микроконтроллера к проводам платы драйвера, шагу и направлению. Затем подключите четвертый контакт к MS1, пятый контакт к MS2, шестой пин-код к MS3 и седьмой контакт для включения. Для питания платы драйвера подключите 12-вольтовый блок питания к разъему адаптера черного зеленого цвета, прикрепленному двумя красными проводами к плате драйвера двигателя.
Загрузите управляющую программу на плату микроконтроллера. Используйте USB-кабель для подключения платы микроконтроллера к компьютеру, который также будет служить источником питания для платы микроконтроллера. После получения Стентора покрывают 35-миллиметровую пластину добавлением трех миллилитров 0,01% раствора полиорнитина к пластине и оставляют на ночь.
Дважды вымойте тарелку сверхчистой водой и один раз пастеризованной родниковой водой. Затем добавьте 3,5 миллилитра пастеризованной родниковой воды на 35-миллиметровую пластину. Добавьте три миллилитра пастеризованной родниковой воды в первую скважину и пять миллилитров во вторую и третью скважины.
Используя пипетку P1000, добавьте два миллилитра Стентора из чашки культуры в первый колодец тарелки из шести лунок. Определите отдельный стентор с помощью стереомикроскопа, а затем используйте пипетку P20 для переноса 100 стентора из первой скважины во вторую скважину. Аналогичным образом, после идентификации отдельного стентора с помощью стереомикроскопа, как показано ранее, перенесите 100 стенторов из второй скважины в третью скважину с помощью пипетки P20.
Затем, используя пипетку P200, переведите 100 стенторов в общем объеме 500 микролитров из третьей скважины из шести пластин скважин в 35-миллиметровую пластину таким образом, чтобы конечный объем составлял четыре миллилитра. Приклейте лист белой бумаги к металлической линейке на устройстве привыкания, следя за тем, чтобы левый край бумаги находился в двух сантиметрах от ближайшего к якорю конца линейки. Используя двустороннюю ленту, приклейте нижнюю часть 35-миллиметровой пластины к центру бумаги на два дюйма поверх линейки на устройстве привыкания.
Оставьте 35-миллиметровую пластину на устройстве привыкания не менее чем на два часа с закрытой крышкой. Центрируйте камеру USB-микроскопа непосредственно над 35-миллиметровой пластиной Stentor. Чтобы установить приложение для записи веб-камеры, откройте приложение веб-камеры и выберите USB-микроскоп в раскрывающемся меню.
Отрегулируйте фокусировку на камере USB-микроскопа так, чтобы ячейки были четко в поле зрения, а положение камеры максимизировать количество ячеек в поле зрения. После открытия последовательного монитора платы микроконтроллера выберите «без окончания строки» и установите для него значение 9 600 бод. Используйте команду L на плате микроконтроллера, чтобы опустить якорь до тех пор, пока он едва не коснется линейки, и команду R, чтобы поднять руку, если это необходимо, чтобы отрегулировать точное положение.
Используйте команду I для инициализации автоматического режима на устройстве привыкания. Введите размер шагов и время между импульсами в минутах в командной строке. Начните снимать видео с помощью приложения веб-камеры, нажав красную кнопку записи.
Затем переверните переключатель на привыкающем аппарате, чтобы начать эксперимент с первой автоматизированной механической подачей импульсов. Непосредственно перед тем, как на видео появится первый механический импульс, сделайте паузу и подсчитайте количество стенторов, которые одновременно закреплены на дне 35-миллиметровой пластины и вытянуты в вытянутой трубообразной форме. Точно так же после первого импульса подсчитайте количество стенторов, которые закреплены на дне пластины и сжимаются в шарообразную форму.
Разделите второй отсчет на первый счет, чтобы определить долю стентора, которая сократилась в ответ на механический стимул, повторив процедуру для всех механических импульсов в эксперименте. Вероятность сокращения стентора контролировалась, и результаты показали, что она постепенно снижается в течение одного часа. После получения уровня четыре механические импульсы с частотой один кран в минуту, указывающие на привыкание.
Изменение силы или частоты подачи механического импульса может изменить динамику привыкания Стентора. При использовании второго уровня импульсный набор частотой один кран в минуту исключает привыкание в течение одного часа. Мы можем изучать различные типы динамики привыкания, изменяя силу и частоту механической стимуляции.
Это возможность изучить различные типы обучения, такие как сенсибилизация. Количественные идеи об обучении одиночных клеток, почерпнутые из наших методов, могут вдохновить другие способы перепрограммирования клеток в многоклеточных тканях. Еще один потенциальный способ борьбы с болезнями.
Обзор
В данном исследовании представлен новый метод количественной оценки привыкания у одноклеточного организма Stentor с использованием аппарата на базе микроконтроллера для подачи контролируемых механических импульсов. Данный подход направлен на расширение нашего понимания простых механизмов обучения, что может дать ключ к пониманию таких состояний, как СДВГ и синдром Туретта.
Основные компоненты исследования
Область исследования
- Нейробиология
- Клеточные механизмы обучения
- Исследования единичных клеток
Теоретические основы
- Габитуация представляет собой базовую форму обучения и памяти.
- Понимание поведения одиночной клетки может раскрыть фундаментальные парадигмы обучения.
- В данном исследовании напрямую оценивается сократительная реакция Stentor на механические стимулы.
Используемые методы
- Автоматизация подачи стимулов на базе микроконтроллера
- Stentor, одноклеточный организм
- Генерация механических импульсов и видеомониторинг
Основные результаты
- Продемонстрировано прогрессирующее снижение вероятности сокращения Stentor в течение часа при механической стимуляции.
- Изменения силы или частоты стимуляции существенно влияли на динамику габитуации.
- Разработан метод исследования различных типов обучающего поведения в одиночных клетках.
Выводы
- Данное исследование позволяет глубже понять механизмы клеточной габитуации и ее вариабельность при различных условиях стимуляции.
- Эта работа имеет значение для более широких биологических исследований, особенно для понимания процессов обучения в более сложных системах.
Часто задаваемые вопросы
Значимость для промышленности
Количественный анализ габитуации у Stentor coeruleus представляет собой уникальную платформу для анализа механизмов обучения на уровне отдельных клеток независимо от нейронных связей. Эта возможность позволяет биофармацевтическим компаниям проводить исследования (R&D)&Командам предоставляются возможности для изучения фундаментальных адаптивных форм поведения, что способствует снижению механистических рисков и повышению прогностической достоверности на ранних этапах поиска. Данный подход дает трансляционные представления о клеточном обучении, применимые в нейробиологии и портфелях моделей заболеваний.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях&D
Ранние этапы поиска и валидация мишени
- Позволяет исследовать адаптивные поведенческие реакции в контролируемой, количественно определяемой системе.
- Способствует механистическому снижению рисков путем изоляции явлений обучения от сложных нейронных сетей.
- Облегчает основанное на гипотезах исследование клеточных вычислений и процессов, подобных памяти.
Скрининг и разработка анализа
- Обеспечивает стандартизированную автоматизированную платформу для подачи и измерения механических стимулов.
- Позволяет получать воспроизводимые количественные данные о вероятности сокращения для сравнительного анализа.
- Обеспечивает масштабируемую разработку анализа для скрининга соединений, влияющих на клеточную габитуацию.
Трансляционные и доклинические исследования
- Предлагает модель для изучения нарушений обучения, имеющих значение при нейроонтогенетических расстройствах.
- Обеспечивает преемственность между исследованиями клеточной адаптации и изучением многоклеточных систем.
- Позволяет проводить оценку рисков при разработке терапевтических мишеней, вовлеченных в патологии, связанные с габитуацией.
Интеграция конвейеров и рабочих процессов
Данный метод встраивается в континуум научных открытий — от ранних механистических исследований до разработки доклинических моделей, предоставляя многоразовую платформу для анализа адаптивного поведения.
- Биология открытий: позволяет количественно оценить обучение и адаптацию на уровне отдельных клеток, уточняя гипотезы о сигнальных путях.
- Скрининг: обеспечивает автоматизированную и воспроизводимую механическую стимуляцию для получения стабильных результатов анализа.
- Аналитика: позволяет проводить статистическое сравнение вероятностей сокращения при различных экспериментальных условиях.
- Трансляционные исследования: связывают данные об обучении клеток с моделированием систем, имеющих значение для изучения заболеваний.
- Корпоративное повторное использование: создает гибкую установку для проведения различных исследований по обучению и адаптации.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: Повышает прогностическую достоверность механизмов адаптивного ответа и валидации мишеней.
- Операционная ценность: Стандартизирует подачу стимулов и количественную оценку ответа для обеспечения сопоставимости между различными исследованиями.
- Стратегическая ценность: Обеспечивает принятие обоснованных решений о продолжении или прекращении разработки (go/no-go) за счет снижения неопределенности в моделях клеточного обучения.
- Влияние на портфель: Позволяет проводить приоритизацию мишеней и путей, связанных с обучением и габитуацией, с учетом оценки рисков.
Особенности реализации
- Требуются навыки программирования микроконтроллеров и количественного поведенческого анализа.
- Необходимо оборудование для автоматизированной механической стимуляции и видеозахвата с высоким разрешением.
- Требуется межкомандная стандартизация параметров стимулов и оценки ответов.
- Метод может быть адаптирован для других одноклеточных или простых многоклеточных систем, обладающих механической чувствительностью.
- Применимость ограничена поведением, которое можно измерить с помощью сокращения или аналогичных наблюдаемых показателей.
