Анализ и визуализация остеоцитов

Предполагается, что напряжение сдвига потока жидкости является механическим стимулятором остеоцитов. Поскольку прямое измерение не является вариантом, модели остеоцитов, полученные с помощью конфокальных изображений, являются ценным инструментом для проведения вычислительного анализа динамики жидкости для оценки напряжений потока жидкости на дендритных мембранах остеоцитов. Часть работы, выполненной в нашей лаборатории, соответствует последним разработкам в этой области, где фактическая морфология лакун остеоцитов, включая извилистость и плотность дендритов, используется вместе с костной и лакунарно-каналикулярной сетью для численного определения напряжения сдвига потока жидкости и мест в дендритной структуре остеоцитов, где напряжение высокое.

Современные технологии включают в себя различные вычислительные модели, такие как анализ конечных элементов, вычислительная гидродинамика, взаимодействие структуры жидкости, моделирование на основе изображений, включая рентгеновский или конфокальный микроскоп для точных 3D-моделей, а также системы механических испытаний для проверки моделей путем измерения реакции костей, таких как деформации в условиях контролируемого нагружения. Наши результаты показывают, что потеря дендритов из-за старения или заболевания костей является фактором, приводящим к тому, что кости становятся менее чувствительными к физической активности. Мы предположили, что остеоциты обнаруживают механические нагрузки через области напряжения сдвига с высоким потоком жидкости, которые являются дендритами.

А напряжение сдвига потока жидкости коррелирует с подобной лакунарной морфологией, особенно с площадью поверхности. С созданием этого протокола мы в настоящее время работаем над проектом NIH по изучению напряжения сдвига потока жидкости в дендритах остеоцитов костей мышей двух разных возрастов и полов. Это исследование поможет определить, как старение и половые различия влияют на механическую трансдукцию в кости из-за нагрузки.

Для начала зафиксируйте бедренную кость, собранную у мыши, в холодном 4% параформальдегиде в фосфатно-солевом буфере на 24 часа при температуре четыре градуса Цельсия с легким покачиванием. На следующий день промойте кость и буферизованный фосфатами солевой раствор и быстро заделайте его в быстро полимеризующийся акрил. Нарежьте толстыми поперечными ломтиками размером 300 микрометров выше третьего вертела.

С помощью наждачной бумаги отполируйте срезы кости до окончательной толщины от 90 до 100 микрометров. Затем промойте полированные участки в 70%95% и 100% этаноле в течение пяти минут каждая. Окрашивайте срезы в 1%-ный С-100%-ный этанол в течение четырех часов в темноте с умеренным встряхиванием.

Далее тщательно промойте срезы в 100% этаноле. И высушите их на воздухе в течение ночи, прежде чем поместить в каплю монтажного носителя на предметное стекло. Закрепите на образце защитное накладку.

На конфокальный микроскоп установите 488-нанометровый лазер для возбуждения и окно сбора излучения от 496 до 596 нанометров. Во-первых, сделайте маломощное изображение всего участка кости с помощью объектива 5x. Затем сделайте снимки трех областей интереса с помощью 20-кратного объектива.

Используйте масляный объектив с числовой апертурой 100x 1,44 с цифровым зумом 1,7 и шагом 0,126 микрометра для сбора детализированных стеков Z из 400 Z-плоскостей размером 1024 x 1024 пикселей и разрешением 0,089 микрометра. Для компьютерного моделирования остеоцитов мыши откройте программу ImageJ после импорта собранных изображений Z стека бедренной кости мыши в формате TIFF, настройте порог в меню раздела для изменения пределов интенсивности пикселей для включения в маску. Используя операцию маски обрезки, обрежьте одну лакуну с каналикулами в качестве области интереса.

Заключите лакуну в воображаемый куб большего размера со сторонами 21, 14 и 19 микрометров. Выполните операцию увеличения области для выбора соединенных областей пикселей для создания однородной лакунарно-каналикулярной сети или LCN. Далее, используя операцию вычисляемой детали, преобразуем лакунарно-каналикулярную маску в объект.

Уменьшите объем LCN с помощью операции разглаживания для построения остеоцитарных и дендритных мембран. Затем экспортируйте объекты. Объедините две поверхности дендритных мембран LCN и остеоцитов в одну поверхность.

Теперь используйте операцию remesh для создания объемной модели лакунарного каналикулярного пространства. Экспортируйте модель в виде файла STL и настройте масштаб объекта с точностью до микрометров. В программном обеспечении для обработки трехмерных изображений выберите объемную модель лакунарно-каналикулярного пространства мыши в качестве базовой модели для построения различных моделей остеоцитов.

Выберите более низкий порог, чтобы уменьшить интенсивность света изображения и получить лакуну с меньшим количеством каналов. Затем разработайте модели остеоцитов с различной толщиной лакунарно-каналикулярного пространства или диаметром дендритных каналик. Создавайте большие или меньшие модели остеоцитов с помощью операций обертывания или сглаживания соответственно.

Чтобы создать поток жидкости в программном обеспечении для моделирования, импортируйте разработанные геометрии на основе конфокальных изображений в программное обеспечение CFX. Установите размеры единиц измерения в нанометрах. Далее нажмите на вычесть, чтобы получить единое тело лакунарного каникулярного пространства.

Щелкните правой кнопкой мыши по сгенерированному фасету и преобразуйте его из фасетов в сплошную область без объединения граней. Нажмите на сетку и выберите линейные тетраэдрические элементы с размером элемента 0,06 микрометра. Уточните сетку с помощью исследования сходимости сетки.

Теперь выделите поверхность и выберите каналы на верхней стороне воображаемого куба в качестве входных отверстий для жидкости. Используя коробку, выберите каналы на остальных пяти гранях в качестве выходов жидкости. Затем экспортируйте сетку.

После создания еще одного потока жидкости импортируйте текучую сетку в раздел настройки CFX. Используя параметр "Вставить границу", задайте два граничных условия для входов и выпусков для граней. Оказывайте давление на входе жидкости 300 и ноль паскалей на входе и выходе соответственно.

Остальные поверхности обрабатывайте как стены с условием отсутствия скольжения. В библиотеке материалов обрабатывайте интерстициальную ламинарную жидкость как воду. Установите секции теплопередачи, сгорания и теплового излучения в положение «Нет».

Выберите турбулентность в качестве характеристики жидкости в LCN. Затем запустите программное обеспечение, используя двойную точность и прямой запуск в качестве типа отправки. Вставьте новый контур в раздел результатов программного обеспечения для вычислительной гидродинамики.

Создайте напряжение сдвига потока жидкости или контур FFSS, выбрав сдвиг стенки на дендритных мембранах остеоцитов в качестве переменной в домене. Далее вставьте контур скоростных линий внутрь лакунарно-каналикулярной области, начиная от входных отверстий. Средний FFSS на остеоцитарных и дендритных мембранах в модели молодого остеоцита составил 0,42 Паскаля, что было значительно выше, чем 0,13 Паскаля в модели старого остеоцита.

FFSS увеличивался в остеоцитах с большим лакунарным каналикулярным пространством, как видно в модели 7 и модели 8, где модель 8 показала самый высокий FFSS. Самые низкие значения FFSS в 0,19 Паскаля и 0,13 Паскаля наблюдались во второй и четвертой моделях соответственно с самой низкой плотностью каналикулов. Не наблюдалось существенных изменений в FFSS при увеличении диаметра дендритов, как это было в моделях 5 и 6.