Одношаговая стратегия мечения эндогенных генов у Drosophila melanogaster на основе CRISPR
26 января 2024 г.
В данной работе мы представляем упрощенный протокол эндогенного мечения генов дрозофилы, в котором используется метод на основе ПЦР для безмаркерной идентификации успешных генетических модификаций, способствующий развитию стабильных линий knock-in.
Целью этого протокола является генерация эндогенной отредактированной линии мухи. В качестве примера мы показываем флуоресцентный нокаут белка, но он также может быть применен к другим нокаутам, нокаутам, а также к генерации мутаций. Наш протокол основан на гомологичной рекомбинации CRISPR, поэтому практически нет ограничений на сайты мутаций.
Более того, наш протокол значительно сократил время и усилия, затрачиваемые на этапы генотипирования. Для начала откройте веб-сайт fly CRISPR, чтобы спроектировать sgRNA для дрозофилы, и введите примерно 100 последовательностей пар оснований, окружающих желаемое место вбивания. Выберите мишени CRISPR с опцией с пятью простыми гуанинами.
Нажмите кнопку найти мишени CRISPR, чтобы сгенерировать список возможных последовательностей sgRNA. Затем нажмите кнопку оценки для каждой последовательности и выберите две сгРНК, которые не имеют отклонений от целей. Поскольку естественные уровни экспрессии белка, как правило, намного ниже, выбирайте флуоресцентные метки, которые являются яркими и фотографическими, и подходят для экспериментальной установки.
Затем разработайте линкер для связывания эпитопных меток с флуоресцентным маркером для биохимического анализа. Используйте пептид-линкер, содержащий от двух до 20 аминокислот, включающий такие аминокислоты, как глицин и серин. Чтобы спроектировать донорский вектор для дрозофилы, организуйте последовательность ДНК пептида-линкера и флуоресцентной метки и обеспечьте гомологичные последовательности, фланкирующие оба конца.
Модифицируйте любые последовательности PAM в донорской плазмиде, чтобы сохранить полученную аминокислотную последовательность белков. Далее расположите начальный и конечный кодоны в зависимости от расположения метки. Для внутреннего мечения убедитесь, что флуоресцентная метка находится в кадре с кодирующей последовательностью целевого гена.
Для мечения N-конца расположите флуоресцентную метку после эндогенного стартового кодона. Для маркировки С-конца расположите флуоресцентную метку перед естественным стоп-кодоном. Убедитесь, что сохранен только один начальный кодон, чтобы избежать потенциальных проблем с переводом.
Используйте альтернативный подход к клонированию на основе фермента рестрикции для вставки последовательности sgRNA в плазмиду U6 Bbs1-chiRNA. После создания плазмиды sgRNA трансформируют плазмиду в DH5-Alpha Escherichia coli в соответствии с инструкциями производителя. Проверьте полученные клоны с помощью секвенирования по Сэнгеру, используя стандартные праймеры секвенирования Т3 или Т7.
Для создания донорской плазмиды используют двухцепочечную ДНК с нужной последовательностью и интегрируют ее в плазмиду Bluesript 2SK отрицательный сайт множественного клонирования. Секвенирование плазмиды-донора, чтобы убедиться, что последовательности sgRNA или PAM правильно модифицированы и в плазмиде отсутствуют SNP. Затем берут мух Cas9, которым вводят сконструированную гРНК и донорские плазмиды.
Обезболивайте мух углекислым газом и отделяйте самцов мух от девственных самок. Чтобы установить скрещивание мух, соедините каждого самца с нулевым уровнем G по крайней мере с двумя девственными самками FM7L в отдельных узких пищевых флаконах CT. Поместите скрещенные флаконы в вентилируемый инкубатор при температуре 25 градусов Цельсия и влажности 60% до тех пор, пока F1 не закроется.
Затем обезболивают и собирают не менее 10 девственных потомков женского пола от скрещивания самцов и самок G zero. Убедитесь, что каждая муха F1 помечена сведениями о ее происхождении и хранится отдельно. Для скрининга мух для ПЦР разработайте праймеры с температурой плавления около 55 градусов по Цельсию, которые охватывают место редактирования целевого гена.
Приготовьте лизисный буфер для каждого образца мухи и выдайте 10 микролитров в каждую лунку 96-луночного ПЦР-планшета. Поддерживайте буфер при низкой температуре во время процесса рассечения ноги. Далее подготовьте стеклянные капиллярные трубочки, заполнив один конец пищей из сахарозо-агара.
Поместите эти трубки в глубокую тарелку глубиной 96 лунок, называемую гостиницей для мух. Для рассечения ноги поместите прокладку для углекислого наркоза под стереомикроскоп. Обезболите муху-кандидата и отрежьте ей одну из средних ног.
После этого погрузите ножку в лизисный буфер. Удерживайте крыло мухи тонкими металлическими щипцами. Переместите муху в гостиницу для мух и сразу же запечатайте трубку пряжей.
Разместите муху в вентилируемом инкубаторе, поддерживаемом при температуре 25 градусов по Цельсию и влажности 60%. Погрузите отрубленные ножки в лизисный буферный раствор в термоамплификаторе. Организуйте реакцию ПЦР в соответствии с инструкциями производителя, используя 1,5 микролитра лизата муховых лапок в качестве источника ДНК.
Подвергнуть продукты ПЦР электрофорезу в агарозном геле и интерпретировать результаты в зависимости от размера полосы. Основываясь на результатах гелевых тестов, выберите положительные мушки из флай-отеля и по отдельности скрестите их с балансирными мухами, чтобы получить поколение F2. Используйте гомозиготные подвои для секвенирования по Сэнгеру сайта редактирования, чтобы обеспечить точность.
Обратное скрещивание линий мух с мухами дикого типа для удаления фоновых мутаций. Скрининг каждого поколения с использованием протокола ПЦР с одной ногой. Конфокальные микроскопические изображения мозга взрослых дрозофил показали, что менструальный белок организован в дискретные ядерные очаги в течение поздней ночи и раннего утра.
В целом, этот протокол надежен, если ваши праймеры для генотипирования ПЦР специфичны.
Обзор
В данном исследовании представлен упрощенный протокол маркировки эндогенных генов у Drosophila с использованием метода ПЦР для идентификации успешных генетических модификаций без использования маркеров. Данный подход облегчает создание стабильных линий с нокаутом-инсетом (knock-in), что продемонстрировано на примере флуоресцентного белка; метод может быть адаптирован для других генетических модификаций.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Нейронауки
- Генетика
- Исследования Drosophila
Теоретические основы
- Технологии редактирования генов, такие как CRISPR, ускорили процесс внесения генетических модификаций в модельные организмы.
- Эндогенное мечение позволяет наблюдать за поведением и взаимодействием белков.
- Эффективные методы генотипирования необходимы для подтверждения успешности модификаций.
Цель исследования
- Для оптимизации процесса создания и подтверждения генетически модифицированных линий Drosophila.
- Для предоставления протокола, позволяющего сократить время проведения процедур генотипирования.
- Для расширения применимости методов гомологичной рекомбинации с помощью CRISPR.
Используемые методы
- Использовали гомологичную рекомбинацию CRISPR у Drosophila для редактирования генов.
- Основные этапы включали разработку sgRNA и конструирование донорных плазмид.
- Проводили ПЦР-скрининг модифицированных линий для подтверждения успешного редактирования.
- Критически важные этапы включали препарирование ног для сбора образцов и ПЦР-амплификацию с использованием специфических праймеров.
Основные результаты
- В исследовании был успешно продемонстрирован эффективный метод создания нок-ин линий с флуоресцентными белками у Drosophila.
- Было отмечено сокращение времени генотипирования и повышение точности подтверждения генетических модификаций.
- Полученные линии мух продемонстрировали соответствующие паттерны локализации белков, необходимые для дальнейших биологических исследований.
Выводы
- Данный протокол значительно упрощает создание и валидацию генетически модифицированных линий Drosophila.
- Он расширяет возможности исследователей по использованию моделей Drosophila для различных генетических исследований.
- Эффективность и гибкость этого метода могут способствовать более глубокому пониманию функций белков и генных взаимодействий in vivo.
Часто задаваемые вопросы
Практическая значимость для промышленности
Эффективное мечение эндогенных генов у Drosophila melanogaster ускоряет валидацию функции и локализации белков, что способствует раннему поиску мишеней и снижению механистических рисков в биофармацевтических исследованиях и разработках. Одноэтапный протокол на основе CRISPR с ПЦР-скринингом устраняет зависимость от видимых маркеров, оптимизируя создание стабильных генетически модифицированных линий. Данный подход повышает прогностическую достоверность и эффективность отбора проектов в портфеле, обеспечивая быструю безмаркерную проверку генетических модификаций в модельных системах, релевантных для изучения заболеваний.
Стратегические области применения в биофармацевтических исследованиях и разработках
Ранний поиск и валидация мишени
- Позволяет напрямую исследовать локализацию и функцию белков in vivo для валидации мишеней.
- Способствует снижению механистических рисков за счет обеспечения точного эндогенного мечения без использования экзогенных маркеров.
- Облегчает быстрое создание генетически определенных линий для исследований, основанных на проверке гипотез.
Скрининг и разработка анализа
- Обеспечивает валидированные биологические системы без использования маркеров для последующего фенотипического скрининга.
- Повышает воспроизводимость и стандартизацию анализа с помощью генотипирования на основе ПЦР.
- Позволяет масштабировать производство модифицированных линий для надежной оценки соединений.
Трансляционные и доклинические исследования
- Соответствует разработке моделей, релевантных для изучения заболеваний, за счет поддержки исследований динамики белков in vivo.
- Обеспечивает преемственность от этапа открытия до доклинической валидации благодаря использованию стабильных, генетически охарактеризованных линий.
- Снижает биологическую неопределенность в трансляционных исследованиях путем подтверждения точности генетического редактирования.
Интеграция в конвейер и рабочий процесс
Данный одноэтапный протокол CRISPR-тегирования интегрируется в процесс раннего поиска и идентификации ведущих соединений, создавая основу для последующего скрининга и доклинических исследований.
- Поисковая биология: Поддерживает проверку гипотез и уточнение сигнальных путей, обеспечивая визуализацию поведения белков в режиме реального времени.
- Скрининг: Позволяет получать воспроизводимые безмаркерные линии, подходящие для количественного фенотипического анализа.
- Аналитика: Использует генотипирование на основе ПЦР и секвенирование по Сэнгеру для надежного подтверждения генетических модификаций.
- Трансляционные исследования: Способствует согласованию с моделями заболеваний за счет возможности отслеживания белков in vivo.
- Корпоративное повторное использование: Создает воспроизводимый рабочий процесс для различных приложений по редактированию и мечению генов у Drosophila.
Операционное и организационное воздействие
- Научная ценность: повышает прогностическую достоверность и снижает механистическую неопределенность при валидации мишеней.
- Операционная ценность: оптимизирует генотипирование, повышает воспроизводимость и поддерживает масштабируемое создание линий.
- Стратегическая ценность: улучшает процесс принятия решений о продолжении или прекращении разработки (go/no-go) и эффективность использования капитала за счет ускорения валидации моделей.
- Влияние на портфель: позволяет проводить приоритизацию с учетом рисков и продвигать генетически модифицированные модели.
Особенности реализации
- Требуется опыт в дизайне CRISPR, конструировании плазмид и генетике Drosophila.
- Необходим доступ к оборудованию для ПЦР, секвенированию по Сэнгеру и конфокальной микроскопии.
- Требуется межкомандная стандартизация протоколов генотипирования и скрининга.
- Метод адаптируем к различным генным мишеням и стратегиям тегирования в моделях Drosophila.
- Достоверность результатов зависит от специфичности дизайна sgRNA и подбора праймеров для ПЦР.
