Обнаружение продукции активных форм кислорода в иммунном ответе риса в режиме реального времени с помощью хемилюминесцентного анализа
November 25th, 2022
Здесь мы описываем метод обнаружения в режиме реального времени продукции апопластических активных форм кислорода (АФК) в тканях риса в иммунном ответе, вызванном патогенным молекулярным паттерном. Этот метод прост, стандартизирован и дает высоковоспроизводимые результаты в контролируемых условиях.
Этот протокол описывает оптимизированный метод хемилюминесценции на основе L-012 для обнаружения продукции АФК в режиме реального времени при обнаружении PAMP в тканях риса. Этот метод прост, стандартизирован и легко воспроизводим в строго контролируемых условиях. Продемонстрирует эту процедуру Он Ин, аспирант из моей лаборатории.
Для начала стерилизуйте очищенные семена риса 70% этанолом в течение одной минуты, затем 40% гипохлоритом натрия в течение одного часа. Промойте семена пять раз стерильной водой, чтобы удалить остатки хлора. В методе рисовой оболочки непосредственно поместите семена в стерильный стеклянный сосуд со средой Murashige и Skoog или MS.
Чтобы разместить семена методом листового диска, положите их на пластины MS на пять-семь дней, а затем пересадите в матрицу роста или почву. Выращивайте рассаду в комнате для выращивания с 12-часовым светом, 12-часовым темным фотопериодом. Разрежьте оболочку с 10-дневных рассад риса на трехмиллиметровые сегменты острым бритвенным лезвием или хирургическим лезвием для предварительной обработки за день до анализа АФК.
Поместите пять сегментов оболочки в отдельную лунку из 96-луночной микротитровальной пластины, содержащей 100 микролитров двойной дистиллированной воды, на 10-12 часов. Срежьте листовые диски с четырех-шестинедельных рисовых растений с помощью биопсийного перфоратора с поршнем. Всегда обрезайте листовые диски от средней трети второго листа основного культиватора, чтобы уменьшить отклонение данных.
Затем поместите один листовой диск в отдельную лунку из 96-луночной микротитровальной пластины, содержащей 100 микролитров двойной дистиллированной воды, на 10-12 часов для предварительной обработки. Держите все листовые диски плавающими и обращенными вверх в лунках микротитровальной пластины для предварительной обработки воды, чтобы избежать отклонений, связанных со стороной листа. Приготовьте раствор для выявления, комбинируя 9,4 миллилитра 50 микромолярного Tris Hcl, 400 микролитров раствора L012, 100 микролитров пероксидазы хрена и 100 микролитров Flg22.
Добавьте в лунки 200 микролитров раствора. Запустите программное обеспечение и нажмите кнопку экспериментов, чтобы создать новый протокол или использовать существующий протокол. Нажмите «Процедура» во всплывающем окне, чтобы настроить пластину, и выберите скважины из пластины, которые необходимо контролировать.
Нажмите кнопку start kinetic и установите время выполнения на 30 минут или больше, в зависимости от экспериментальных требований. Выберите минимальный интервал, чтобы получать показания как можно чаще. А для времени интеграции выберите одну секунду или дольше в зависимости от интенсивности сигнала.
Нажмите «Подтвердить», затем «ОК», чтобы подтвердить настройки, затем нажмите «Обнаружить новую пластину» во всплывающем окне и подождите, пока программное обеспечение не предложит диалоговое окно загрузочной пластины. Осторожно удалите двойную дистиллированную воду из лунок, содержащих предварительно обработанные ткани, избегая повреждения тканей или высыхания. Используйте многоканальную пипетку, чтобы добавить 200 микролитров раствора в лунки, содержащие ткани.
Поместите тестируемую пластину на носитель и начните обнаружение. Для индуцирования АФК с помощью Flg22 использовались листовые диски и трехмиллиметровые ножны. Генерация АФК контролируется в течение 35 минут.
Столбцы обозначают средние значения стандартных отклонений, рассчитанные на основе пяти технических повторов. В рисе увеличение производства АФК было впервые обнаружено через одну-две минуты, достигло пика через 10-12 минут и вернулось к исходному уровню примерно через 30-35 минут. Общее количество АФК рассчитывалось по кривой.
Чтобы получить общее количество значений ROS, примените формулу к соответствующим наборам данных, чтобы вычислить ROS, сгенерированные за каждый интервал времени, которые можно объединить, применив сумму формулы для расчета общей сгенерированной суммы. Одно отверстие или две половинки листового диска помещали в лунки 96-луночной микротитровальной пластины, предварительно обработанной 100 микролитрами двойной дистиллированной воды в течение 10-12 часов, а затем обрабатывали Flg22 для индукции АФК. Значения показаний двух образцов половинного диска намного выше, чем у всего листового диска.
В среднем, общие значения из двух образцов полудиска почти в 1,6 раза выше, чем для всего листового диска, что пропорционально длине края, а не площади образцов. Этот результат подтверждает, что АФК в основном генерируются в клетках в месте раны. Пытаясь выполнить эту процедуру, работайте с тканями осторожно и не делайте лишних надрезов, которые могут быть источником вариации данных.
Этот метод может быть применен к любым другим физиологическим процессам, продуцирующим АФК в тканях растений.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Обзор
В этом исследовании представлен метод для обнаружения в реальном времени апоплазматических активных форм кислорода (РАК) в тканях риса в процессе иммунных реакций, вызываемых молекулярными паттернами, ассоциированными с патогенами (ПМП). Протокол оптимизирован для простоты использования и воспроизводимости в контролируемых лабораторных условиях.
Ключевые компоненты исследования
Область исследования
- Иммунные реакции растений
- Обнаружение активных форм кислорода
- Рис как модельный организм
Предпосылки
- Значимость РАК в сигнализации растений
- Роль ПМП в иммунном ответе
- Необходимость надежных методов измерения
Использованные методы
- Хемолюминесценция на основе L-012 для обнаружения РАК
- Ткани риса как биологическая модель
- Использование микротитровочных блоков для мониторирования в реальном времени
Основные результаты
- Пиковая продукция РАК наблюдается через 10-12 минут после вызова
- Метод позволяет дифференцировать уровни РАК в образцах целых и полудисках листьев
- Высокостабильные результаты в нескольких повторных опытах
Выводы
- Этот метод предоставляет надежный инструмент для изучения динамики РАК в иммунитете растений.
- Он применим к различным физиологическим процессам, связанным с продукцией РАК.
Часто задаваемые вопросы
Executive Industry Relevance
Real-time chemiluminescence detection of reactive oxygen species (ROS) in rice provides a standardized, quantitative approach for interrogating immune response mechanisms in plant systems. This capability enables high-confidence target validation and mechanistic de-risking at early discovery stages, supporting translational continuity for crop protection and plant biotechnology portfolios. The method's reproducibility and scalability position it as a reusable platform for comparative immune signaling studies across diverse plant models.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables quantitative interrogation of PAMP-triggered immune signaling pathways in plant tissues.
- Supports functional validation of NADPH oxidase (RBOH) family proteins as immune response mediators.
- Facilitates mechanistic de-risking by providing real-time ROS burst kinetics upon elicitation.
- Improves predictive confidence for downstream genetic or chemical modulation strategies.
Screening & Assay Development
- Delivers a standardized, high-throughput assay format using 96-well microtiter plates.
- Ensures reproducibility and comparability of ROS measurements across technical repeats.
- Generates quantitative, time-resolved ROS output curves for robust compound or genotype screening.
- Enables assay scalability and platform reuse for diverse ROS-producing physiological processes.
Translational & Preclinical Research
- Aligns with translational biomarker strategies by quantifying ROS as a hallmark of immune activation.
- Supports continuity from early discovery through preclinical validation in plant biotechnology pipelines.
- Provides risk-adjusted advancement criteria based on reproducible immune response metrics.
- Offers predictive de-risking for candidate gene or pathway prioritization in crop improvement programs.
Pipeline & Workflow Integration
This chemiluminescence assay integrates into the discovery-to-validation continuum for plant immune signaling, enabling seamless transition from hypothesis testing to lead identification and preclinical assessment.
- Discovery Biology: Quantifies ROS burst kinetics to clarify immune pathway activation and validate functional targets.
- Screening: Provides assay readiness and reproducibility for high-throughput evaluation of genetic or chemical modulators.
- Analytics: Delivers time-resolved, quantitative ROS measurements for comparative analysis across conditions.
- Translational Research: Bridges early discovery findings to preclinical validation by aligning with immune response biomarkers.
- Enterprise Reuse: Establishes a standardized platform adaptable to multiple plant models and immune signaling contexts.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in immune response studies.
- Operational Value: Enhances standardization, reproducibility, and scalability of ROS detection workflows.
- Strategic Value: Supports informed go/no-go decisions and capital-efficient portfolio advancement.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of immune signaling targets and pathways for crop biotechnology.
Implementation Considerations
- Requires expertise in plant tissue handling and chemiluminescence assay setup.
- Needs access to microtiter plate readers with kinetic detection capabilities.
- Demands strict standardization of tissue preparation and elicitation protocols to minimize data variation.
- Adaptable across different plant species and ROS-producing physiological processes with protocol optimization.
- Careful tissue handling is critical to avoid artifactual ROS generation at wound sites.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Introduction
0:36
Plant Culture
1:20
Tissue Preparation and Pretreatment
2:37
Setting up the Protocol with the Microplate Reader, Establishing the Elicitation System, and Measuring Real-Time ROS Production
3:42
Results: ROS Induction, the Total Amount of ROS Generated, and ROS Production in the Exposed Cells of the Cut Edge
5:07
Conclusion
