Изучение эпителиальных эффектов воспаления кишечника in vitro на установленных колоноидах мышей
2 июня 2023 г.
Мы описываем протокол, подробно описывающий изоляцию крипт толстой кишки мышей для развития трехмерных колоноидов. Затем сформированные колоноиды могут быть терминально дифференцированы, чтобы отразить клеточный состав эпителия хозяина до того, как они получат воспалительную инструкцию или будут направлены на создание эпителиального монослоя.
В рамках нашего исследования мы стремимся изучить, как мышиные колоноиды могут быть модифицированы из обычной системы колоноидных культур, изучить определенные аспекты физиологии кишечника и их изменения при наличии воспаленного болезненного состояния. Изучение барьерной функции и физиологии кишечника при таких болезненных состояниях, как воспалительное заболевание кишечника, ограничено при использовании традиционной системы культивирования толстой кишки мышей, которая отражает только физиологию стволовых клеток. Преимущество нашего протокола заключается в том, что он предоставляет читателю несколько методов для изучения того, как медиаторы воспаления влияют на эпителий кишечника, либо терминально дифференцируя их, либо создавая двухмерную монослойную систему.
В будущем наша лаборатория сосредоточится на понимании того, как можно изменить систему культивирования колоноидов человека для исследования различных аспектов физиологии кишечника и заболеваний, в частности, воспалительных заболеваний кишечника.
Просмотрите полный транскрипт и получите доступ к тысячам научных видео
Обзор
В данном исследовании представлен протокол выделения крипт толстой кишки мыши для создания трехмерных колоноидов, которые могут быть дифференцированы для имитации кишечного эпителия. Этот подход позволяет исследовать физиологию кишечника и барьерную функцию при патологических состояниях, в частности, при воспалительных заболеваниях кишечника.
Основные компоненты исследования
Область исследований
- Физиология кишечника
- Системы культивирования колоноидов
- Воспалительные заболевания кишечника
Теоретические сведения
- Традиционные культуры колоноидов отражают только физиологию стволовых клеток.
- Ограничения исследований в понимании воспалительных ответов в кишечном эпителии.
- Необходимость в усовершенствованных моделях для имитации патологических состояний.
Используемые методы
- Выделение крипт толстой кишки мыши и выращивание колоноидов.
- Терминальная дифференцировка для моделирования эпителия хозяина.
- Создание системы 2D-монослоя для детального изучения барьерной функции.
Основные результаты
- Успешно созданы колоноиды, имитирующие кишечный эпителий.
- Продемонстрировано влияние медиаторов воспаления на целостность эпителия.
- Разработана новая платформа для изучения воспалительных заболеваний кишечника.
Выводы
- Данный протокол позволяет более точно моделировать воспалительные реакции в кишечнике.
- Результаты имеют важное значение для понимания и лечения заболеваний кишечника.
Часто задаваемые вопросы
Практическая значимость для отрасли
Моделирование ответов кишечного эпителия на воспаление имеет решающее значение для снижения рисков при поиске терапевтических средств для лечения ВЗК на ранних стадиях. Описанные системы колоноидов мыши и 2D-монослоев позволяют напрямую исследовать барьерную функцию и физиологию эпителия в условиях, соответствующих патологии. Данный подход повышает прогностическую достоверность валидации мишеней и обеспечивает трансляционную преемственность для портфелей гастроинтестинальных препаратов.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Ранний поиск и валидация мишени
- Позволяет механистически исследовать нарушение эпителиального барьера, имеющее значение для патогенеза ВЗК.
- Обеспечивает функциональную валидацию мишеней путем моделирования воздействия воспалительных медиаторов на дифференцированные эпителиальные клетки.
- Способствует снижению биологических рисков за счет разграничения ответов стволовых клеток и терминально дифференцированных клеток.
Скрининг и разработка анализа
- Обеспечивает платформу для количественной оценки барьерной функции в ответ на воспалительные стимулы.
- Позволяет подготавливать стандартизированные системы 2D-монослоев для воспроизводимого скрининга соединений.
- Поддерживает разработку анализов для оценки влияния терапевтических вмешательств на целостность эпителия.
Трансляционные и доклинические исследования
- Сопоставляет результаты исследований in vitro с патологическими реакциями эпителия, наблюдаемыми при ВЗК.
- Обеспечивает преемственность между механистическими исследованиями на стадии поиска и доклинической валидацией методов терапии, модулирующих барьерную функцию.
- Способствует принятию обоснованных решений о продвижении разработки с учетом рисков путем моделирования признаков заболевания человека в мышиных системах.
Интеграция конвейера и рабочего процесса
Данный протокол связывает этапы первичного поиска и доклинических исследований, обеспечивая возможность проверки гипотез относительно функции эпителиального барьера и воспалительных реакций в контролируемых условиях in vitro.
- Фундаментальная биология: обеспечивает проверку гипотез о влиянии медиаторов воспаления на физиологию эпителия.
- Скрининг: предоставляет воспроизводимые количественные показатели целостности барьера для оценки соединений.
- Аналитика: позволяет измерять конфлюэнтность эпителия и барьерную функцию в определенных условиях.
- Трансляционные исследования: моделирует клинически значимые изменения эпителия для сопоставления с доклиническими биомаркерами.
- Корпоративное использование: создает многократно используемую платформу, адаптируемую к различным воспалительным и терапевтическим контекстам.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: Повышает прогностическую уверенность в валидации эпителиальных мишеней и снижает механистические риски.
- Операционная ценность: Стандартизирует моделирование воспаления кишечника in vitro для обеспечения воспроизводимости и масштабируемости.
- Стратегическая ценность: Обосновывает решения о продолжении или прекращении разработок («go/no-go»), предоставляя функциональные показатели, релевантные заболеванию.
- Влияние на портфель: Позволяет проводить приоритизацию терапевтических кандидатов для лечения ВЗК и заболеваний ЖКТ с учетом рисков.
Рекомендации по внедрению
- Требуется опыт работы с культурами органоидов и знание биологии эпителиальных клеток.
- Необходим доступ к специализированным вставкам для культивирования клеток и аналитическому оборудованию для оценки барьерной функции.
- Требуется межгрупповая стандартизация методов обработки воспалительными медиаторами и протоколов считывания данных.
- Метод может быть адаптирован для различных систем колоноидов мыши или, потенциально, человека при условии оптимизации протокола.
- Ограничения включают возможное расхождение с эпителиальными ответами in vivo и масштабируемость для высокопроизводительного скрининга.
