Зависимая от напряжения регистрация тока калия на кардиомиоцитах H9c2 с помощью метода цельноклеточного пластыря-зажима

Этот протокол успешно регистрирует влияние аконитина на IKv клеток H9C2. Продвижение новых этапов исследования механизма кардиотоксичности лекарственных средств с точки зрения ионных каналов. Метод цельноклеточного зажима является золотым стандартом исследования ионных каналов с высокой чувствительностью, высокой точностью и высокой специфичностью.

Метод цельноклеточного пластырного зажима может быть использован для изучения фармакологических или токсических механизмов сопоставления специфических ионных каналов для мультисистемных заболеваний, таких как сердечно-сосудистая система и нервная система. Для начала переварите клетки с 0,25% трипсина в течение 30 секунд, как только чашка для культивирования H9C2 станет на 80% сливающейся. Культивировать 2 раза по 10 -5 клеток на миллилитр с нормальной средой или лекарственной средой, содержащей среду, в 35-миллиметровую посуду, покрытую стеклянными пластинами в течение 24 часов при 37 градусах Цельсия, с 5% атмосферой углекислого газа и относительной влажностью от 70 до 80%.

Включите съемник микропипетки и разогрейте в течение 30 минут. Затем нанесите боросиликатное стекло капилляр с нитью на катушку микропипетки. Выберите программу и нажмите на ввод на панели управления.

Нажмите на программу рампы в правом верхнем углу, чтобы определить теплоту стеклянного капилляра. Напишите программу для вытягивания электрода в соответствии со значением, определенным тестом рампы, и нажмите на pull, чтобы начать изготовление пипеток. Включите цифровой аналоговый преобразователь, усилитель сигнала, микроманипулятор, микроскоп и камеру.

Последовательно откройте приложение для обработки изображений, программное обеспечение усилителя сигнала и программное обеспечение для сбора данных. Нажмите «Получить» и выберите протокол редактирования в программном обеспечении для сбора данных. Отредактируйте программу в интерфейсе осциллограммы.

Введите значения для первого уровня, дельта-уровня, первой длительности и дельта-длительности для эпохи A, эпохи B и эпохи C. Затем щелкните интерфейс скорости режима и задайте данные иерархии пробных испытаний. Затем нажмите на протокол редактирования, чтобы выбрать кнопку стимулирования и установить программу вычитания утечки в диалоговом окне вычитания утечки PM. Чтобы установить путь хранения данных, щелкните файл и выберите задать имена файлов данных в программном обеспечении для сбора данных.

Затем откройте установленный протокол lKv, выбрав получить и щелкнув открытый протокол в программном обеспечении для сбора данных. Наконец, нажмите на опцию инструментов и выберите тест мембраны, чтобы начать запуск протокола. Добавьте внеклеточный раствор в клеточную ванну на цельклеточном зажимном аппарате и поместите крышку вверх с клетками H9C2 в ванне.

Заполните 30% пипетки внеклеточным раствором и установите его на держатель регистрирующего электрода, интегрированный в зажимной аппарат. Затяните пипетку держателем записывающего электрода. Затем опустите пипетку в ванну с микроманипулятором.

Нажмите на интерфейс смещения пипетки программного обеспечения усилителя сигнала, чтобы поддерживать базовую линию тока lKv на нулевом пикоампере. Подайте соответствующее положительное давление вручную с помощью 1,0-миллилитрового шприца, подключенного к держателю записывающего электрода, через пластиковую трубку. Слегка переместите пипетку, манипулируя микроманипулятором в трех измерениях, чтобы связаться с клеткой.

После того, как мембрана тестирует квадратную волну, падение на одну треть до половины после того, как пипетка коснется клеточной мембраны, удалите положительное давление и вручную доставьте соответствующее отрицательное давление. Затем нажмите на интерфейс патча программного обеспечения для сбора данных, чтобы сформировать gigaseal. Используйте программное обеспечение медленного усилителя сигнала с компенсацией емкости во время потолка ячейки, чтобы компенсировать быструю и медленную емкость.

Применяйте короткие импульсы отрицательного давления, чтобы разорвать участок клеточной мембраны. Выполните компенсацию емкости цельноклеточной мембраны, нажав на кнопку всей ячейки программного усилителя сигнала. Наконец, сохраните и запишите данные, нажав на кнопку записи данных.

Откройте сохраненные данные lKv с помощью программного обеспечения для анализа данных. Сохраните отношения напряжения тока. Нажмите на анализ, чтобы выбрать статистику.

Выберите диапазон как Cursors 1 2 для анализа данных, нажмите на кнопки амплитуды пика и среднего значения, а затем нажмите ok, чтобы просмотреть данные на странице результатов. Наконец, скопируйте столбец средних данных lKv в программное обеспечение для рисования функций для дальнейшего анализа. Сохраните репрезентативные текущие трассировки lKv.

Нажмите «Редактировать», чтобы выбрать трассировки передачи, затем выберите полную трассировку в регионе для передачи. Затем нажмите на select в выборе трассировки и выберите IN 0 в сигналах. Наконец, нажмите ok, чтобы просмотреть данные на странице результатов и скопировать общие данные в программное обеспечение для рисования функций, чтобы нарисовать текущие трассировки.

Сохраните протокол lKv. Нажмите на редактирование, чтобы выбрать создать сигнал сигнала сигнала сигнала стимула и выбрать ОК. Затем повторите шаг для рисования текущих трассировок без выбора сигнала.

lKv был вызван 150 миллисекундами деполяризующего импульсного стимула от минус 40 до плюс 60 милливольт при удерживающем потенциале минус 60 милливольт. lKv кардиомиоцитов крыс H9C2 сначала появился около минус 20 милливольт, а затем амплитуда увеличилась с дальнейшей деполяризацией. По сравнению с контрольной группой, амплитуда lKv была заметно снижена после пяти минут лечения 1,5 миллимоляром 4-AP.

Кроме того, lKv значительно снижался при мембранных потенциалах от 10 до 60 милливольт в зависимости от дозы, после 24-часового лечения переменным током. Отдельная клетка после записи ионного канала может быть использована для дальнейшей оценки одноклеточной омики, такой как одноклеточная геномика, транскриптомика, протеомика и метаболомика.