Тестирование эффективности in vitro и in vivo мРНК-липидных наночастиц, полученных путем микрофлюидного смешивания

Этот протокол может быть использован для создания консистентных липидных наночастиц, инкапсулирующих МРА. Параметры рецептуры могут быть настроены, а различные липидные наночастицы могут быть оценены с точки зрения их эффективности и биораспределения. Стандартизированный протокол для разработки состава липидных наночастиц и тестирования in vitro и in vivo может быть использован для создания согласованных липидных наночастиц, которые можно сравнивать друг с другом.

Существует множество мелких деталей, которые следует иметь в виду при составлении и оценке потенции наночастиц, но какие именно детали были учтены? Приготовление состава не должно быть сложным. Начните с наполнения чистого четырехлитрового стакана 200-300 миллилитрами свежего 10-кратного PBS и разбавьте его до 1-кратного значения сверхчистой водой.

Убедитесь, что окончательный объем PBS составляет от двух до трех литров. Поместите диализные кассеты соответствующей емкости для липидной наночастицы, или состава LNP, в полевой стакан. Сделайте десятикратное разведение 100-миллимолярного буферного запаса лимонной кислоты с использованием сверхчистой воды, чтобы создать 10-миллимольный буфер лимонной кислоты для разведения мРНК.

Затем приготовьте C 12 200 ионизируемые липидные, хелперные липиды, холестериновые и липидные закрепленные растворы ПЭГ или липидные ПЭГ, растворив каждый липид в 100% этаноле. Обеспечьте полное растворение исходных растворов, нагревая и смешивая их при температуре 37 градусов Цельсия. Объедините рассчитанные объемы различных липидных компонентов в конической пробирке.

Разбавьте липиды 100%-ным этанолом до конечного объема V, который составляет 25% от конечного объема LNP. Рассчитайте количество мРНК, необходимое для составления рецептуры, исходя из весового соотношения ионизируемых липидов и мРНК и общего объема мРНК-ЛЯП. Затем разморозьте люциферазу светлячка, кодирующую мРНК, на льду.

Затем разбавляют мРНК до конечного объема, в три раза превышающего органическую фазу, используя 10-миллимольный буфер лимонной кислоты. Распылите на деликатную салфетку обеззараживающее поверхностное средство для РНК и ДНК и тщательно протрите внутреннюю часть микрофлюидного инструмента. Затем откройте новый микрофлюидный картридж и вставьте его впускными каналами вниз и в сторону.

Расположите две стерильные конические пробирки объемом 15 миллилитров на держателе при снятых крышках. После этого наполните шприц объемом пять миллилитров раствором мРНК, содержащим мРНК, разведенным в 10-миллимолярном буфере лимонной кислоты. Затем наполните трехмиллилитровый шприц липидным раствором, содержащим липиды, разведенные в 100% этаноле.

Убедитесь, что из шприцев удален воздух. Затем без иглы вставьте пятимиллилитровый шприц, содержащий раствор мРНК, в левое входное отверстие картриджа, а трехмиллилитровый шприц, содержащий липидный раствор, в правое отверстие картриджа. Включите микрофлюидный прибор и выберите быстрый запуск.

После выбора правильных типов шприцев для вставленных шприцев объемом пять и три миллилитра введите параметры для состава LNP в соотношении водной и органической потоков три к одному, прежде чем нажать кнопку запуска для формулы мРНК-LNP. Загрузите мРНК-ЛЯП, собранные в правую коническую пробирку, в предварительно гидратированные диализные кассеты с помощью шприца, не прокалывая и не прикасаясь к мембране кассеты, поместите диализные кассеты, содержащие мРНК-ЛЯП, обратно в стакан с PBS и дайте им диализироваться в течение не менее двух часов. После диализа диализные кассеты, содержащие мРНК-ЛЯП, поместить в стерильный шкаф биобезопасности и удалить мРНК-ЛЯП с помощью шприца с иглой.

Стерильную фильтрацию мРНК-ЛЯП с помощью шприцевого фильтра 0,22 мкм и сбор их в стерильную коническую пробирку. Затем поместите 65 микролитров раствора мРНК-ЛЯП в микропробирку объемом 1,5 миллилитра для характеризации. Планшет 5 000 клеток HepG2 в белой стенке, прозрачное дно, 96-луночное планшет в 100 микролитрах полной питательной среды клеток и инкубируют клетки в течение ночи в контролируемом инкубаторе при температуре 37 градусов Цельсия, содержащей 5% углекислого газа.

Перед обработкой клеток мРНК-ЛЯП удалить из лунок всю среду. Затем обрабатывают клетки либо 100 микролитрами мРНК-ЛНЧ, разведенными в полной питательной среде клеток в желаемых дозах, либо 100 микролитрами полной среды перед 24-часовой инкубацией. После инкубации извлеките питательную среду из 96-луночного планшета, добавьте в каждую лунку 20 микролитров лизисного буфера, а затем 100 микролитров реагентов для анализа люциферазы.

Защитите планшет от света и поместите планшет в считыватель пластин для измерения биолюминесцентного сигнала. Раствор мРНК-ЛЯП разбавляют стерильным PBS так, чтобы в 100 микролитрах объема инъекции в хвостовую вену присутствовало два микрограмма общей мРНК. Наполните инсулиновый шприц 29-го калибра 100 микролитрами мРНК-LNP или 100 микролитрами PBS и удалите из шприца все пузырьки.

Введите иглу скосом вверх в боковую хвостовую вену мыши и медленно введите 100 микролитров мРНК-ЛНП или ПБС. Через шесть часов после инъекции приготовьте 15 миллиграмм на миллилитр бульонного раствора калийной соли D-люциферина в стерильном ПБС. В программном обеспечении для обработки изображений для системы визуализации in vivo (IVIS) установите флажок рядом с люминесценцией перед нажатием кнопки «Инициализировать», чтобы подготовить прибор к сбору данных.

Затем вводят 200 микролитров D-люциферина в брюшину мышам, ранее обработанным и ждите 10 минут, пока сигнал люциферазы стабилизируется, прежде чем обезболивать мышей. Перенесите мышей под наркозом в носовые конусы внутри системы визуализации in vivo, убедившись, что они лежат на спине с обнаженным животом, прежде чем закрыть дверцу камеры. В программном обеспечении для обработки изображений убедитесь, что выбрано правильное поле зрения, и установите время экспозиции на авто, нажмите кнопку получения в программном обеспечении, чтобы получить биолюминесцентные изображения.

Эффективность инкапсуляции мРНК-ЛЯП была определена как 92,3% с использованием модифицированного флуоресцентного анализа и уравнения, показанных здесь. Повышение биолюминесценции наблюдалось при обработке 5 000 клеток HepG2 возрастающими дозами мРНК-ЛЯП. Экспрессия люциферазы была легко обнаружена при самой низкой дозе в пять нанограммов на лунку.

Сильный сигнал биолюминесценции наблюдался в верхней части брюшной полости мышей, получавших ЛНЧ. Вокруг печеночных сигналов были нарисованы интересующие области для расчета общего люминесцентного потока. Суммарный люминесцентный поток был примерно в пять раз по 10 к 9-му.

Всегда соблюдайте массовое соотношение ионизируемых липидов и нуклеиновых кислот при составлении LNP. Каждый объем органической фазы должен содержать ионизируемый липид, соответствующий мРНК в трех объемах водной фазы.