Зондирование структуры РНК с мутационным профилированием диметилсульфата с секвенированием in vitro и в клетках

DMS-MaP - это метод, основанный на секвенировании, который позволяет нам получить снимок структуры РНК и узнать, как она изменяется в разных условиях. В отличие от традиционных методов определения структуры, таких как кристаллография и электронная микроскопия, DMS-MaP может использоваться в клетках и ансамблях деконволютных структур РНК. Поскольку структура РНК имеет значение во множестве биологических явлений, наш метод может обеспечить механистическое понимание практически любой области биологических исследований.

Начните с переноса 89 микролитров буфера переворачивания в назначенную 1,5-миллилитровую трубку для каждой реакции, имеющей конечный объем 100 микролитров. Предварительно прогрейте трубку при 37 градусах Цельсия в термошейкере, размещенном под химическим капотом. Добавьте 10 микролитров воды без нуклеазы в трубку ПЦР и перенесите в нее от одной до 10 пикомолей РНК.

Инкубируйте его в термоциклере при 95 градусах Цельсия в течение одной минуты, чтобы денатурировать РНК. А затем немедленно поместите трубку на ледяную глыбу, чтобы избежать неправильного сворачивания РНК. Теперь, чтобы повторно свернуть РНК, добавьте образец в назначенную трубку, содержащую буфер повторного складывания при 37 градусах Цельсия, и хорошо перемешайте его перед инкубацией в течение 10-20 минут.

Далее добавляют один микролитр 100% диметилсульфата, или ДМС, имеющего концентрацию 10,5 моляра, в пробирку, содержащую образец РНК, и инкубируют реакционную смесь в течение пяти минут, встряхивая ее со скоростью от 800 до 1 400 оборотов в минуту. После пятиминутной реакции погасите его 60 микролитрами 100% бета-меркаптоэтанола и хорошо перемешайте перед вихрем и немедленно поместите РНК на лед. Затем очистите РНК и элюируйте ее в 10 микролитрах воды без нуклеазы.

Количественно оцените РНК с помощью спектрофотометра. Наконец, храните модифицированную РНК при минус 80 градусах Цельсия. После добавления реакционной смеси в трубку ПЦР перенесут по меньшей мере 100 нанограммов элюированной модифицированной РНК в 10 микролитрах воды без нуклеазы в трубку ПЦР.

Инкубировать смесь при 57 градусах Цельсия в течение 30 минут до 1,5 часов в термоциклере. 30 минут достаточно, чтобы сделать продукт, содержащий 500 нуклеотидов. Затем добавьте к нему один микролитр из четырех молярных гидроксидов натрия, хорошо перемешайте пипеткой и инкубируйте при 95 градусах Цельсия в течение трех минут, чтобы разложить РНК, и освободить TGIRT из комплементарной ДНК.

Используя колоночный подход для удаления праймеров, очистите комплементарную ДНК. И выполните ПЦР, чтобы усилить его. Проверьте успешность ПЦР, запустив два микролитра продукта ПЦР на агарозном геле, прежде чем приступить к библиотечному препарату.

Затем количественно оцените извлеченные фрагменты с помощью спектрофотометра перед индексацией фрагментов для секвенирования. Перенесите инфицированные вирусом клетки, выращенные до желаемой стадии инфекции, в специальный и соответствующий вытяжной шкаф, имеющий требуемый уровень биобезопасности. Добавьте 2,5% объема DMS к питательной среде, содержащей клетки, и запечатайте контейнер парапленкой.

Сразу же высиживают емкость при температуре 37 градусов Цельсия в течение пяти минут. После инкубации тщательно выбрасывайте и выбрасывайте ДМС-содержащую среду в соответствующие химические отходы. Затем осторожно добавьте 10 миллилитров стоп-буфера в ячейки, соскоблите клетки и перенесите их в 15-миллилитровую коническую трубку.

Гранулируйте клетки путем центрифугирования трубки в течение трех минут по 3000 г. Удалите супернатант и промыть гранулу ячейки два раза 10 миллилитрами PBS. Осторожно удалите остатки PBS как можно больше после стирки.

Растворите гранулу в соответствующем количестве реагента выделения РНК для выполнения экстракции РНК. Затем добавьте 200 микролитров хлороформа к одному миллилитру гомогенизированных клеток в реагенте выделения РНК и вращайте его в течение 15-20 секунд, пока клеточный раствор не станет ярко-розовым. Подождите, пока не произойдет разделение фаз, о чем свидетельствует оседание розовой липидной фазы на дне.

Вращайте трубку со скоростью около 20 000 г в течение 15 минут при четырех градусах Цельсия, прежде чем перенести верхнюю водную фазу в новую трубку. Очищают РНК и элюируют в достаточном объеме безнуклеазной воды. Затем, после выполнения истощения рибосомной РНК с использованием предпочтительного подхода, элюируют РНК в достаточном объеме воды, свободной от нуклеазы, и количественно оценивают ее с помощью спектрофотометра.

Очищенная РНК может быть использована снова в ОТ-ПЦР. Используя упомянутый веб-сервер, данные DMS-MaP могут быть удобно проанализированы. Чтение сопоставляется со ссылкой, а мутации для каждой базы подсчитываются.

Полученные файлы среднего уровня популяции могут быть использованы в качестве ограничений в хорошо известном программном обеспечении для прогнозирования структуры РНК. Полученные минимальные структуры свободной энергии могут быть визуализированы с помощью программного обеспечения, такого как VARNA. На данный момент только стабильная версия DREAM может деконволютировать ансамбли структуры РНК.

Тем не менее, работа по тому, чтобы сделать эту функцию более доступной для всего сообщества, продолжается. Транскрипция in vitro фрагмента gBlock, удлиненного присоединением промотора полимеразы Т7, генерировала интересующую РНК, появляющуюся в виде одной полосы при 300 нуклеотидах на 1% агарозном геле. Об успехе ген-специфической ОТ-ПЦР, выполненной на модифицированной ДМС РНК, свидетельствовала одна полоса в 300 парах оснований на 2%-агарозном геле.

Индексированный фрагмент оказался примерно на 150 пар оснований выше, чем ожидалось. Лечение ДМС проводили на клетках HCT-8, проявляющих цитопатический эффект через четыре дня после заражения вирусом. Извлеченная общая РНК появилась на агарозном геле в виде двух ярких полос, составляющих субъединицы 40S и 60S.

После истощения рибосомной РНК две яркие полосы исчезли, оставив мазок в соответствующей полосе. После библиотечной подготовки образцы имели различное распределение по размеру и появлялись в виде мазка. Полоса была вырезана между 200 и 500 нуклеотидами, а димеры адаптера были отделены.

Структурная модель генома SARS-CoV-2 показала, что основания с открытой конформацией имеют более высокую реакционную способность по сравнению с теми, которые занимаются спариванием оснований. Профиль реакционной способности оснований указывал на то, что урацил и гуанин имели низкие значения реактивности и не модифицировались СДМ. С помощью нашего метода мы можем прогнозировать структуры в клетках с высокой пропускной способностью без ограничений по размеру.

Контрольные метрики очень важны, потому что они дают представление о точности прогнозов структуры. Чтобы дополнительно проверить точность предсказания, следует провести больше экспериментов, которые нарушают или изменяют структуру.