2,405 Views
•
04:04 min
•
January 20, 2023
DOI:
Этот протокол позволяет нам количественно оценивать статистику иссечения на основе одной клетки, в отличие от рассмотрения массового поведения. На этом уровне мы можем отслеживать поведение отдельных клеток с течением времени, включая их уровни TnpA и TnpB для клеток, которые иссечиваются, по сравнению с клетками, которые этого не делают, что может позволить нам, например, измерить влияние идентифицированных мутационных событий на скорость роста. Этот метод является простым и недорогим способом измерения мутационной динамики живых клеток.
Общий подход применим к любой системе, требующей флуоресцентной визуализации живых клеток. Приготовьте слайд, кипятя M63 с 0,5% глюкозы и 1,5% агарозы в микроволновой печи, чтобы растопить агарозу. Убедитесь, что среда полностью расплавлена и хорошо перемешана.
Дайте смеси остыть до 55 градусов цельсия перед добавлением антибиотиков и индукторов. Поместите предметное стекло микроскопа на верстак. Сложите один слайд перпендикулярно первому.
Убедитесь, что между нижним и верхним слайдом имеется зазор, равный одной толщине затвора. Пипетка один миллилитр смеси агарозы М63 медленно в щель между затворами, чтобы создать небольшой гель-квадрат. Как только гель затвердеет, сдвиньте верхний слайд, чтобы удалить его.
Обрежьте подушечку агарозы лезвием бритвы или ножом. Затем пипетку 2,5 микролитра бактериальной культуры и сверху положите крышку. Запечатайте пространство между затвором и крышкой с помощью эпоксидной смолы.
Дайте эпоксидной смоле высохнуть, и клетки осядут на агарозной подушке в течение одного часа при температуре 37 градусов по Цельсию. Поместите подготовленный образец на флуоресцентный микроскоп в среду, нагретую и поддерживаемую при 37 градусах Цельсия. Для каждой длины волны найдите поле зрения, содержащее минимальную флуоресценцию.
Настройте протокол для получения изображений в сетке на разных длинах волн и через регулярные промежутки времени. События транспозонного иссечения приводят к восстановлению промотора для mCerulean3, что позволяет идентифицировать клетки, подвергающиеся транспозонной активности, с помощью ярко-синей флуоресценции. TnpB повышает скорость транспозонного иссечения.
Клетки, экспрессирующие вспомогательный белок TnpB, испытывают в четыре-пять раз более высокие уровни транспозонной активности по сравнению с TnpB-отрицательными клетками. В TnpB-положительных клетках клетки, подвергающиеся транспозонному иссечению, имеют более высокие уровни экспрессии mCherry TnpB, чем в общей популяции. Более того, для клеток, подвергающихся иссечению, TnpB-положительные клетки экспрессируют лишь незначительно более высокие уровни венозной TnpA-транспозазы, чем TnpB-отрицательные клетки, что выше, чем желтая флуоресценция общей популяции.
Наиболее вероятным местом для борьбы является подготовка клеточной культуры к эксперименту. Вы должны убедиться, что клетки выращены до экспоненциальной фазы и что слайд привит соответствующим количеством клеток. Не забывайте следить за пузырьками при запечатывании слайда, чтобы агарозный гель не высох.
Описан протокол для выполнения живой визуализации в режиме реального времени для количественной оценки того, как вспомогательный белок TnpB влияет на динамику транспозиции в отдельных живых клетках кишечной палочки .
10:22
Use of the TetON System to Study Molecular Mechanisms of Zebrafish Regeneration
Видео по теме
10738 Views
11:12
Determination of the Optimal Chromosomal Location(s) for a DNA Element in Escherichia coli Using a Novel Transposon-mediated Approach
Видео по теме
7578 Views
10:08
Genetic Mapping of Thermotolerance Differences Between Species of Saccharomyces Yeast via Genome-Wide Reciprocal Hemizygosity Analysis
Видео по теме
17175 Views
08:57
Identification of Novel Genes Associated with Alginate Production in Pseudomonas aeruginosa Using Mini-himar1 Mariner Transposon-mediated Mutagenesis
Видео по теме
12444 Views
11:36
Creation of a Dense Transposon Insertion Library Using Bacterial Conjugation in Enterobacterial Strains Such As Escherichia Coli or Shigella flexneri
Видео по теме
16028 Views
11:50
High-throughput Parallel Sequencing to Measure Fitness of Leptospira interrogans Transposon Insertion Mutants During Golden Syrian Hamster Infection
Видео по теме
8976 Views
11:35
Replication of the Ordered, Nonredundant Library of Pseudomonas aeruginosa strain PA14 Transposon Insertion Mutants
Видео по теме
8148 Views
11:03
Massively Parallel Reporter Assays in Cultured Mammalian Cells
Видео по теме
21647 Views
13:31
Generation of Enterobacter sp. YSU Auxotrophs Using Transposon Mutagenesis
Видео по теме
13955 Views
10:13
An Efficient In Vitro Transposition Method by a Transcriptionally Regulated Sleeping Beauty System Packaged into an Integration Defective Lentiviral Vector
Видео по теме
8977 Views
Read Article
Цитировать это СТАТЬЯ
Worcester, M., Manoj, F., Kuhlman, T. E. Real-Time Quantification of the Effects of IS200/IS605 Family-Associated TnpB on Transposon Activity. J. Vis. Exp. (191), e64825, doi:10.3791/64825 (2023).
Copy