В естественных условиях Кальциевая визуализация нейронных ансамблей в сетях первичных сенсорных нейронов в интактных ганглиях дорсальных корешков

Этот протокол описывает хирургическое воздействие на ганглий дорсального корешка (DRG) с последующим GCaMP3 (генетически кодируемый индикатор Ca²⁺ ; Зеленый флуоресцентный белок-кальмодулин-белок M13 3) Ca²⁺ визуализация нейронных ансамблей с использованием мышей Pirt-GCaMP3 при применении различных стимулов к ипсилатеральной задней лапе.

Количество нейронов, контролируемых с помощью этого метода, позволяет собирать данные нейронной сети, которые были бы невозможны при использовании более старых или других методов. Основным преимуществом этой методики является возможность контролировать почти 2 000 первичных сенсорных нейронов одновременно, реагируя непосредственно на раздражители, приложенные к задней лапе. Эта процедура особенно хорошо подходит для изучения терапевтических вмешательств при периферической аллодинии и гиперчувствительности к боли.

Этот метод может быть адаптирован для изучения тройничных или коленчатых ганглиев или использоваться с генетически кодируемыми датчиками напряжения или клеточных сигнальных молекул, таких как циклический АМФ. Для выполнения этой операции требуется практика. Вы можете практиковаться до шести ганглиев дорсальных корешков на одном животном.

Демонстрировать процедуру буду я, при содействии Джона Шеннонхауса и г-на Рубена Гомеса. Для начала поместите мышь на гретую подушку, чтобы поддерживать температуру тела на уровне 37 градусов по Цельсию. Найдите поясничное увеличение, пощупав тазовую кость мыши.

Затем побрейте заднюю часть мыши над областью увеличения поясницы. С помощью ножниц сделайте трехсторонний прямоугольный разрез над поясничным увеличением и откиньте кожу щипцами. Используйте 13-миллиметровые ножницы для рассечения, чтобы сделать три-четыре миллиметра надрезов на правой стороне позвоночника.

Используйте ножницы, чтобы обрезать кожу и мышцы в стороны, чтобы обнажить позвоночник. Затем с помощью восьмимиллиметровых ножниц отрежьте мышцу и соединительную ткань, чтобы очистить поперечный отросток правой стороны L5 DRG. Постарайтесь свести к минимуму кровотечение, используя вату или гелевую пену для поглощения крови.

Разрежьте правую сторону поперечного отростка L5 с помощью ронгеров Фридмана-Пирсона или крепких тонких щипцов, стараясь не касаться DRG. Затем переместите мышь и грелку в пользовательскую рабочую область. Используйте сценическую ленту, чтобы закрепить животное и грелку на месте.

Поместите нос животного в носовой конус для непрерывной изофлурановой анестезии. Закрепите правую заднюю лапу, торчащую за пределами сцены, для легкого применения стимулов. Закрепите позвоночник на месте с помощью ступенчатых зажимов над кожей на позвонках или тазовой кости только рострально и каудально к L5 DRG.

Отрегулируйте зажимы и ступень так, чтобы поверхность ДРГ была максимально ровной. Затем поместите предметный столик под микроскопом так, чтобы объектив находился прямо на восемь миллиметров выше DRG при опускании. Вставьте ректальный термометр.

Подключите линии электропередач к грелке и ректальному термометру. Подсоедините носовой обтекатель к газовым магистралям изофлурана. Используйте вертикальный конфокальный микроскоп с объективом 10x 0,4 DIC и соответствующим программным обеспечением для визуализации.

Используйте настройки зеленого фильтра FITC для возбуждения при 495 нанометрах, излучения при 519 нанометрах и длины волны детектирования от 500 до 580 нанометров. Под микроскопом найдите поверхность ДРГ. Отрегулируйте зажимы на столике так, чтобы поверхность DRG была как можно более ровной, а максимальная площадь поверхности визуализировалась в фокальной плоскости.

Наблюдайте за животным на протяжении всей процедуры, чтобы поддерживать изофлурановую анестезию без передозировки. Чтобы загрузить протокол быстрого сканирования микроскопа, используйте типичные настройки размера вокселя 2,496 х 2,496 х 16 мкм, 512 х 512 пикселей, 10 оптических срезов Z-стека, один блок Эйри на 32 микрометра, 1% мощность лазера 488 нанометров и пять милливатт, время пикселя 1,52 микросекунды, время линии 0,91 миллисекунды, время кадра 465 миллисекунд, скорость сканирования LSM восемь, двунаправленное сканирование, коэффициент усиления детектора ФЭУ 650 вольт и цифровой коэффициент усиления один. Выполните короткое восьмицикловое сканирование DRG, нажав «Начать эксперимент» на вкладке «Приобретение».

Создайте фильм, выполнив ортогональную проекцию сканов по одному скану на кадр с течением времени. Вручную проверьте четкость изображения и артефакты изображения, такие как волны яркости, пересекающие DRG. Отрегулируйте положение зажима и толщину оптического сечения и повторяйте этот шаг до тех пор, пока не будет получен четкий высококачественный фильм.

Затем загрузите протокол сканирования микроскопа с высоким разрешением, используя типичные настройки размера вокселя 1,248 х 1,248 х 14 мкм, 1024 х 1024 пикселей, Z-стек с шестью оптическими срезами, блок Эйри 1,2 или 39 мкм, 5% мощность лазера 488 нанометров и 25 милливатт, время пикселя 2,06 мкс, время линии 4,95 миллисекунды, время кадра 5,06 секунды, скорость сканирования LSM шесть, двунаправленное сканирование, усиление детектора ФЭУ при 650 вольт и цифровое усиление единицы. Нажмите кнопку «Начать эксперимент» на вкладке «Приобретение», чтобы сделать изображение DRG с высоким разрешением. Загрузите протокол быстрого сканирования микроскопа и запишите спонтанную активность в DRG в течение 80 циклов.

Создайте фильм с ортогональной проекцией и убедитесь, что изображение имеет достаточное качество для анализа. Для применения стимулов настройте микроскоп на выполнение от 15 до 20 сканирований. Дождитесь завершения сканирования от одного до пяти, чтобы получить базовый уровень.

Применяйте стимул во время сканирования от шести до 10. Подождите не менее пяти минут после каждого стимула, прежде чем применять следующий, чтобы предотвратить десенсибилизацию. Для механического нажатия держите щипки альгометра лапой между веслами, не касаясь лапы.

Ущипните лапу, начиная сразу после окончания пятого сканирования и прекращая сразу после 10-го сканирования. Контролируйте усилие пресса с помощью альгометра и следите за тем, чтобы оно не превышало желаемого усилия на 10 g. Для тепловых стимулов нагрейте стакан с водой до температуры чуть выше желаемой.

Когда вода нагреется до нужной температуры, примените стимул сразу после пятого сканирования, погрузив лапу в воду. Оттяните стакан сразу после сканирования 10. Хирургическое воздействие L5 DRG с последующей конфокальной микроскопией позволило одновременно визуализировать до 1 800 нейронов с помощью мышей Pirt-GCaMP3.

Первичные сенсорные нейроны наблюдались в ансамбле на популяционном уровне для спонтанных переходных процессов кальция в отсутствие стимулов и в ответ на стимулы в их нормальном физиологическом контексте. Сильные раздражители или вредное тепло усиливали кальциевую реакцию. По сравнению с прессованием с 100 г, нажатие с 300 г увеличивало количество нейронов, продуцирующих кальциевые переходные процессы, и дельту F на площадь F0 под кривой.

Теплое тепло в безвредном диапазоне температур 21 и 45 градусов по Цельсию увеличило количество нейронов, продуцирующих переходные процессы кальция, и дельту F на площадь F0 под кривой. Безвредные температуры активировали меньшее количество нейронов, производящих переходные процессы, по сравнению с вредным тепловым стимулом при 57 градусах Цельсия. Кроме того, нейроны меньшего и среднего диаметра продуцировали переходный кальций спонтанно и под действием всех стимулов, но нейроны большего диаметра продуцировали переходные процессы кальция только в ответ на стимул прессы 300 г.

DRG должна быть ровной и оптимальной оптической толщины среза. Она должна быть такой, чтобы можно было обнаружить максимальное количество ячеек и не было волнистости в фильме. Этот метод был использован для анализа сенсорных модальностей на популяционном уровне для соматочувствительности и вкуса, а также для изучения соседних нейронов, активирующихся парами или в синхронизированных кластерах, способствующих хронической и нейропатической боли.